[发明专利]一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法

权利要求书

1.一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法，其特征在于：

包括以下步骤：

1)构建转录组文库：提取鸟巢蕨叶片总RNA，分离mRNA，反转录合成并纯化cDNA，末端修复、加腺嘌呤核苷连接测序接头，通过琼脂糖凝胶电泳回收大小为200～700bp的片段，将回收片段进行PCR扩增，即构建得到转录组文库；

2)转录组数据的获得：将步骤1)得到的转录组文库用IlluminaHiSeq^TM2000平台进行测序，采用Illumina双末端测序方法，获得转录组测序数据；利用Trinity软件对测序数据进行拼接，将序列拼接成一个完整的转录组；

3)SSR位点查找：

安装Perl语言，从http://pgrc.1pk-gatersleben.de/misa下载est_trimmer.pl并运行以去除所述转录组序列中小于100bp的短序列和大于2000bp的长序列；

从http://www.bioinformatics,org/cd-hit/中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列；

从http://pgrc.1pk-gatersleben.de/misa下载使用MISA软件以查找和定位序列中SSR位点，参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为10、8、5、4、3和3；

4)设计EST-SSR引物：

使用软件primer3.0

http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/l.1.4/primer3-1.1.4-WINXP.zip/download批量设计SSR引物，设定标准为：引物长度为18～23bp，GC含量为40％～60％，Tm值55℃～65℃，并且上下游引物Tm值相差不超过5℃，产物大小为150～400bp。

2.根据权利要求1所述的基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法，其特征在于：步骤1)中所述的测序接头为：

5′RNAAdapter:5′-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3′；

3′RNAAdapter:5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′。

3.根据权利要求1所述的基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法，其特征在于：步骤4)之后还包括以下步骤：

5)EST-SSR引物对的有效性和通用性鉴定：

提取蕨类材料的基因组DNA，利用开发的SSR引物进行PCR扩增，采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测；利用引物开发所用材料的鸟巢蕨基因组DNA进行设计引物有效性PCR鉴定，若能检测到150～400bp扩增片段，说明该引物为有效引物；利用成功扩增的引物对蕨类材料的基因组DNA进行PCR扩增，用于聚类分析验证整个体系的有效性和通用性。

4.根据权利要求3所述的基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法，其特征在于：所述PCR鉴定的反应体系总体积为20μL，其中包括10×PCR缓冲液、25mmol/LMg²⁺、2.5mmol/LdNTPs、10μmol/LSSR引物、60ng基因组DNA、TaqDNA聚合酶及ddH₂O；PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50-60℃退火45s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min；4℃保存；反应结束后，PCR产物加入2μLLoadingbuffer，采用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1×TBE，160V稳压电泳1h，至Loadingbuffer移到凝胶底部时电泳结束；采用银染法染色，最后将凝胶置于凝胶成像系统上拍照；对电泳图谱上有差异且易识别的多态性条带，在同一迁移位置上观察扩增条带的有无：实验数据的统计采用“0”，“1”矩阵的统计方法，即在胶板上有清晰条带记为“1”，在胶板上没有清晰条带则记为“0”，缺失的记为“2”；统计结果生成矩阵后，使用NTSYS-pc2.10e软件进行数据处理，计算品种对之间的遗传相似系数，并获得相似系数矩阵。用SHAN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，得到遗传聚类图。