[发明专利]一种检测人类胚胎染色体微缺失和微重复的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子细胞生物领域，具体涉及一种检测人类胚胎染色体微缺失和微重复的方法，其能够对人类胚胎囊胚期滋养层细胞染色体DNA片段拷贝数变异进行检测。

背景技术

染色体微缺失/微重复是指染色体上出现长度为1.5kb-10Mb的缺失或重复。人类染色体微缺失/微重复综合征是一种因人类染色体上出现微小片段缺失或重复，即DNA片段拷贝数变异，缩写为CNV，引起复杂表型疾病，可导致严重的疾病和异常，如先天性心脏病、生长发育迟缓、肢体畸形等。常见的微缺失综合征包括22q11微缺失综合征、猫叫综合征、安格曼综合症、AZF缺失等。

2009《中国不孕不育现状调研报告》显示，全国不孕不育患者人数已超过5000万，而试管婴儿技术能够有效帮助不孕不育患者解决生育难题。试管婴儿技术是将卵子与精子取出后置于特定的培养液内培养、受精，受精卵在恒温孵箱中发育为胚胎后移植回母体子宫，最终发育成胎儿。试管婴儿技术作为有效的辅助生殖手段成为大多数不孕不育夫妇的重要选择，而挑选健康胚胎移植是成功妊娠的关键。但是，通过试管婴儿方法获得的胚胎有40-60%存在染色体异常，且随着孕妇年龄越大，胚胎染色体异常的风险越高，而染色体异常是导致妊娠失败和自然流产的主要原因，因此，对于植入前的胚胎进行遗传学筛查是至关重要的。胚胎植入前遗传学筛查是指胚胎植入着床之前进行染色体数目和结构异常的检测，挑选正常的胚胎植入子宫，以期获得正常的妊娠，提高患者的临床妊娠率。除了常见的3体综合症外，微缺失和微重复也是胚胎染色体异常的常见类型。

尽管每种微缺失综合征发病率都很低，如较常见的22q11微缺失综合征发生率为1：4000，但由于临床检测技术的限制，大量的微缺失综合征患者在产前筛查和产前诊断中无法检出，更为重要的是作为胚胎植入前诊断的最主要的样本类型，平衡易位患者的胚胎必须通过分析微重复和微缺失来判定胚胎是否发生异常。因此，如果在试管婴儿技术中能够避免移植有染色体微缺失/微重复的胚胎，将具有很重要的意义。

此外，试管婴儿通常会进行多个卵子的体外受精，但为了避免多胎妊娠给孕妇和胎儿带来的风险，移植的胚胎数目最好是1个。为了提高妊娠率，必须对移植的胚胎进行筛选，从而对质量最佳的胚胎进行移植。目前胚胎质量的评估主要依赖于胚胎的形态判断，但胚胎的形态和最终的成功怀孕之间的关联性还不够高。理论上，对胚胎的染色体进行检查是筛选优质胚胎的最佳途径。胚胎染色体检测的最大瓶颈是可以用于检测的细胞数量太少。

现有的针对微缺失/微重复综合征的诊断方法主要有高分辨率染色体核型分析、荧光原位杂交、微阵列-比较基因组杂交、多重连接探针扩增技术和定量PCR的方法等。

高分辨率染色体核型分析采用细胞同步化的方法，通过获得大量优质的有丝分裂晚前期或早中期的显带核型，使单套染色体的条带数量增至数百条以上，从而提高识别染色体细微结构改变的能力，但其分辨率的极限只有约5M，不足以检测更小的染色体水平上的微缺失/微重复变异。而且由于胚胎细胞数量的有限，也无法获得足够的染色体。

荧光原位杂交，缩写为FISH，是微缺失/微重复检测的黄金标准，其可以有效地检测出大部分染色体缺失。如果被检测的染色体或DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体，而经荧光检测体系显示核酸探针，即可对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。中期染色体FISH的分辨率可达1-2M，间期染色体FISH分辨率可达50K，但该技术需在已知缺失位点的情况下，设计探针进行验证，不宜用于发现新的染色体水平的微缺失或重复异常。

微阵列-比较基因组杂交技术，缩写为Array CGH，可将特异DNA片段作为靶探针固化在载体上形成微阵列，通过将荧光素标记的待测DNA和参考DNA与微阵列杂交从而检测DNA拷贝数变异。Array CGH理论上可检测5至10kb甚至更小的DNA序列，但该方法价格昂贵且一般并不覆盖全基因组的所有位点。

多重连接探针扩增技术，缩写为MLPA，是一种针对待测DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。MLPA技术目前在临床实验室已应用于Y染色体微缺失、22q11.2染色体微缺失等的检测，优点是高效、特异、快速、简便，缺点是不适合检测未知的点突变类型。

PCR方法常用于Y染色体微缺失方面的检测，如Y染色体上与男性生殖相关的AZF基因，AZFa、AZFb、AZFc等的缺失则多用PCR的方法进行检测。对于已知的染色体微缺失位点的验证也可以用PCR方法。该方法简便易行，缺点是只能针对已知位点进行检测，且一次仅能针对几个位点进行检测。