[发明专利]一种多样本多片段DNA甲基化高通量测序方法

说明书

技术领域

本发明涉及高通量基因组甲基化DNA检测领域，尤其涉及一种多样本多片段DNA甲基化高通量测序方法。

背景技术

DNA甲基化是一种重要的表观遗传调控因子。在哺乳动物细胞中，DNA甲基化通常发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上，形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化的改变，尤其是抑癌基因启动子区的高甲基化在多种肿瘤的形成和发展过程当中起着重要的作用，同时DNA低甲基化也与癌基因的过表达和染色体的不稳定相关。

当前，研究DNA甲基化的方法有基因组整体甲基化检测的甲基化DNA免疫共沉淀芯片(microarray analysis following methylated DNA immunoprecipitation,MeMeDIP-chip)、甲基化DNA免疫共沉淀测序(sequencing analysis following methylated DNA immunoprecipitation,MeDIP-seq)、简化的表观亚硫酸氢盐测序技术(reduced representation bisulfite sequencing,RRBS)、重亚硫酸盐全基因组测序(bisulfite genomic sequencing)和特异基因位点甲基化检测的传统的重亚硫酸盐克隆测序、焦磷酸测序。其中，单个基因位点DNA甲基化检测的金标准是重亚硫酸盐克隆测序，其利用重亚硫酸盐将基因组DNA中的未甲基化的胞嘧啶(C)修饰为尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶(C)保持不变，在PCR扩增中，尿嘧啶(U)变成胸腺嘧啶(T)，然后将PCR产物连接到特定载体上，转化到感受态细菌中，挑取10个以上单克隆菌株进行一代测序，根据参考序列中胞嘧啶位置C/T的频率来判断该位点的甲基化程度。

最近有文献报道了一种新的定量检测特异片段DNA甲基化的方法，这种方法结合了重亚硫酸盐转化、特异性片段扩增、依赖转座酶的建库方式和第二代测序，称为重亚硫酸盐扩增子测序(BiSulfite Amplicon Sequencing，BSAS)。这种方法可以对特异基因组区域内的甲基化胞嘧啶进行精准的绝对定量。但是该文章中使用的是依赖转座酶的建库方式，使用Illumina公司的Nextera XT建库试剂盒，使用双向标签序列Index，每个测序芯片上可以最多同时检测96个样本。

重亚硫酸盐克隆测序方法是一种可靠性和精确度很高的方法，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但是不足之处是至少要测序10个以上克隆才能获得可靠数据，过程较为繁琐，耗时耗资过多。

BSAS的缺点是对于PCR产物使用转座酶酶切以后，就不能检测PCR产物两端被酶切掉序列的甲基化状态；每个样本需要构建一个文库。而且，还有文献报道扩增子测序中会出现等位基因间PCR重组的现象。

发明内容

针对上述重亚硫酸盐扩增子测序中存在的问题，本发明提供了一种针对多样本多片段的DNA甲基化高通量检测方法，该方法能够在一个文库中同时分析多个样本、多个目标片段的DNA甲基化状态，片段长度可以达到500bp左右，并且PCR重组发生率低，该方法还具有起始样本量少、针对性强、成本低、充分利用测序通量等优点。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种多样本多片段DNA甲基化高通量测序方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：提取基因组DNA，对基因组DNA进行重亚硫酸盐处理，然后对处理好的基因组DNA进行PCR扩增，其中针对不同基因片段使用不同的PCR引物，相同的基因片段使用标签序列区分不同的样本；

步骤二：将步骤一中不同的PCR产物进行混合，使用混合好的PCR产物进行测序文库制备；

步骤三：对测序文库进行QPCR质检定量；

步骤四：上机测序，对不同样本特异性片段甲基化状况进行高精度分析。

为优化上述技术方案，具体措施还包括：

上述样品基因组DNA可以来源于任意物种，包括但不限于动物、植物、昆虫的基因组DNA。

上述步骤1中PCR引物针对不同基因、不同的扩增区域设计，片段长度可以达到500bp左右(最长片段长度大于500bp)；同时在上下游PCR引物的5’端分别加上3个碱基以上的标签序列，含不同标签序列的上下游引物分别组合用以区分不同的样本。

上述步骤一中进行PCR扩增所使用的聚合酶包括针对重亚硫酸盐转换后的DNA的热启动taq酶、常规的r-taq酶或其它聚合酶扩增，优选的是针对重亚硫酸盐转换后的DNA的热启动taq酶；还包括对扩增产物进行1.5％的琼脂糖胶电泳纯化的步骤。