[发明专利]基于DNA Barcoding的六种鲤科鱼类及其生肉制品的鉴别方法及鉴别试剂盒

说明书

背景技术

DNA条形码(DNA Barcoding)是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行物种鉴定的技术。这个概念的原理与零售业中对商品进行辨认的商品条形码是一样的。简单地说，DNA条形码技术的关键就是对一个或一些相关基因进行大范围的扫描，进而来鉴定某个未知的物种或者发现新种(Hebert et al.，2003a；Hebert et al.，2003b；Hebert et al.，2004)。

自从提出DNA条形码的概念以来，这种新兴分类学技术已经引起了越来越多的生物学家的关注。DNA条形码技术是分类学中辅助物种鉴定的新技术，它代表了生物分类学研究的一个新方向(肖金花等，2004)，因此它在生态、环境、食品等诸多领域都将会有广泛的应用(Janzen，2004)。

DNA条形码技术的主要优势有很多，其中包括：(1)鉴定不依赖形态特征，只需提供物种的DNA即可鉴定，一旦某一生物DNA条码数据库建立起来，条形码技术能够快速的从部分零散组织中鉴定到种的水平。(2)对实验的操作技能要求不高，鉴定过程标准化、快速、准确。一个标准DNA条形码数据库的建立，可使各种物种的辨认成为可能，如濒危物种或常见种、土著物种或入侵种等，也使更多的无分类学专业知识的人能够准确的辨认出某个物种。

DNA条形码技术的主要流程包括：提取待检测物种DNA、设计引物PCR扩增、克隆、测序及序列比对，结果分析。其中最关键的是DNA条形码理想序列的确定和标准DNA条形码数据库的建立。

已有研究表明，编码线粒体细胞色素C氧化酶I(CO I)基因是许多鱼类(Savolainen et al.，2005；Ward et al.，2005)、昆虫(Smith et al.，2005；Ahrenset al.，2007；Elias et al.，2007；张媛等，2011)和鸟类(Hebert et al.，2004；Tavares and Baker，2008)等动物分类与鉴别的理想DNA条形码。

鲤科是世界现生淡水鱼类中最大的科，也是分布区域最广的一个科，其中亚洲地区鲤科鱼类的物种分化最为显著，而东亚地区是亚洲鲤科鱼类多样性最为丰富的地区之一。

在长期的历史发展中，中国人赋予鲤鱼以丰富的文化内涵。在中国传统饮食文化中就有“无鲤不成席”的说法。与中国老百姓生活息息相关的常见的鲤科鱼类除了鲤鱼还有青鱼、团头鲂、草鱼、白鲢、鲫鱼等，为此迫切需要针对上述鱼肉制品，特别是生肉制品，开发一种准确、高效的鉴定方法，为鱼肉制品的溯源和安全监管提供技术支持。

另外，近年来，随着我国经济的高速发展，生态问题日益突出，为外来物种的入侵提供了便利条件，给当地鱼类开发和保护带来隐忧。而鲤科鱼类作为我国水生环境的指标生物，不仅可作为水体净化指标，还可以作为外来物种入侵检验指标，同时其多样性指标也可以反映其生境状态。

如何快速有效的识别鱼类，特别是鲤科鱼类，成为迫切需要解决的问题。但是，由于传统的形态分类学目前得不到足够的重视，形态分类的专业人员逐步减少，影响了鱼类资源保 护以及生境研究等工作。

向燕等在《清水江鲤鱼线粒体COI基因序列变异及遗传多样性》一文中对清水江鲤鱼线粒体细胞色素氧化酶亚基I(COI)基因序列的变异及遗传多样性进行了研究。结果表明清水江鲤鱼COI序列变异较丰富，但其遗传多样性较低。结果分析显示，流域环境变化和生境破碎化导致采样水域鲤鱼的特有性适应和基因交流频繁或许是形成现状的重要影响因素。

王茜等《四种常见鲤科鱼类DNA条形码的研究》、彭居俐《东亚特有鲤科类群的DNA条形码研究及其系统发育分析》中均是采用的线粒体CO1基因靠近5’末端的一段长度为814-816bp的序列，该序列在鲌属、鲌亚科和东亚特有鲤科鱼类中，能够有效的区分各物种。

虽然使用上述方法可用于鉴别部分鲤科鱼类，但是该方法存在需扩增和测序的特异性DNA片段长，测序成本高且结果分析复杂等问题，不利于上述常见鲤科鱼类及其生肉制品鉴定方法的推广以及物种保护、生境研究等科研工作的开展。

发明内容