[发明专利]一种冬虫夏草分子身份证及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及一种冬虫夏草分子身份证及鉴定方法。

背景技术

冬虫夏草(Ophiocordyceps Sinensis)为麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。是我国珍稀名贵中药材。由于冬虫夏草本身的生境特殊，生长缓慢，天然产量有限，加上生态环境的破坏和长期过度采挖，其自然资源逐渐枯竭。目前冬虫夏草价格比黄金还贵，市场上常出现其混伪品。如：古尼虫草C.gunnii，蝉花C.cicadae，蛹虫草C.militaris，下垂虫草O.nutans,罗伯茨虫草O.robertsii等。由于冬虫夏草与其近缘种、混伪品外形类似，传统的性状鉴别对冬虫夏草与其近缘种的鉴定有一定困难。这就需要寻找到一种稳定可靠的方法将冬虫夏草药材加以鉴定区分。

现有的对冬虫夏草的传统鉴别方法在实际运用中要进行准确鉴别难度极大，且存在主观性大，通用性差，且对观察者经验要求高等缺陷。而分子鉴别手段比较准确可靠，但都需要测序或是大量PCR和电泳及后期数据处理，也不利于规模化标准化建立。

因此有必要开发一种结果准确且鉴定过程简便快速的冬虫夏草分子鉴定方法。

发明内容

本发明的目的在于克服传统鉴别技术中存在的上述缺陷，提供一种结果准确灵敏，鉴定过程简便快速的冬虫夏草鉴定方法。

为达到以上目的，本发明的发明人在对大量的样品的筛选过程中，寻找出能够将正品冬虫夏草与混伪品进行精确区分的正品冬虫夏草的特异分子身份证序列，并提供了对冬虫夏草鉴别较为快速，简便，廉价的方法。

具体的，本发明提供了一种冬虫夏草分子身份证，所述分子身份证中含有如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

可选的，所述分子身份证为SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述分子身份证为SEQ ID No.1所示的序列。

在本发明的另一种实施方式中，所述分子身份证为SEQ ID No.2所示的序列。

本发明提供了一种冬虫夏草的鉴定方法，其中，所述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在本发明所述的分子身份证。

可选的，所述方法包括如下步骤：

1)以待测样品基因组DNA为模板，对所述分子身份证进行PCR扩增，获得扩增产物；

2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中是否存在所述分子身份证。

当存在SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的片段时可以判定被测样品中存在冬虫夏草成分或为冬虫夏草。相反，如果既不存在SEQ ID No.1所示的片段也不存在SEQ ID No.2所示的片段时，判定被测样品为伪品。

本发明对于PCR所使用的引物无特别的限制，只要能够对所述分子身份证进行扩增即可，为了获得最佳的鉴定效果，所述PCR扩增使用的引物为：

ITSF 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′(SEQ ID No.3所示的核苷酸序列)，

ITSR 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(SEQ ID No.4所示的核苷酸序列)。

可选的，所述PCR扩增的反应程序为：

可选的，所述PCR扩增的反应体系为：

LATaq PCR buffer II(Mg²⁺Plus)(10×)2.5μL，dNTPs混合物1μL(2.5mmol/L)，引物各0.6μL(10μmol/L)，模板DNA 1μL(约30ng)，LA TaqDNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL。

其中，所述待测样品包括冬虫夏草及同属近缘种及伪混品。

所述待测样品的形式可以为药材和菌丝体，利用本发明所提供的方法可以对因加工而难以通过形态学鉴定进行区分的检测对象进行准确的鉴别，例如可以对粉末形式的样品进行鉴定。

本发明提供了所述方法或所述的分子身份证在鉴定冬虫夏草中的应用。

利用本发明所提供的分子身份证和方法可以准确的将冬虫夏草与形态特征相似的伪品区分开，本发明所提供的方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的冬虫夏草任何样品。因此，能够实现冬虫夏草原药材和菌丝体、粉末和混淆品的快速、准确鉴定。

附图说明