[发明专利]一种pCr-NHEJ载体及其构建方法及其用于细菌基因定点敲除的应用

说明书

技术领域

[本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种pCr-NHEJ载体及其构建方法及其用于细菌基因定点敲除的应用。

背景技术

2013年出版的《Science》报道了一种简单、高效的基因定点编辑技术——CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat; CRISPR-associated，CRISPR-Cas9）。该技术系统由一种来自链球菌的Cas9核酸酶、一个序列恒定的tracrRNA（trans-activating crRNA）和一个与靶基因特异性互补的20nt-crRNA（CRISPR RNAs）组成。tracrRNA的3’端形成的高级结构结合并激活Cas9，tracrRNA的5’端与crRNA的3’端互补连接，而crRNA的5’端与靶基因互补配对，由此引导Cas9到达并切断靶序列。现在已经把两种小RNA 融合成一条RNA 链，简称sgRNA（single guide RNA），采用sgRNA进行操作更便捷。由于该技术只需要针对靶基因设计一段特异性的crRNA序列，即可快捷地实现基因的定点敲除。这一技术不仅彻底改变了传统基因组定点编辑技术的概念，并在短短两年内被成功应用于对多种生物的基因组进行定点敲除、敲入或者突变。

sgRNA 分子由间隔序列（spacer）和trancrRNA两段序列构成：1）间隔序列长度为20nt，与基因的靶位点互补，它位于PAM（Protospacer-Adjacent Motif）序列（NGG）的5’端，需要根据靶基因序列单独设计；2）tracrRNA序列恒定，能结合并激活Cas9蛋白质。在spacer的引导下，sgRNA将活化的Cas9蛋白带至基因的靶位点，在PAM序列上游3-8碱基间将靶基因的DNA 双链切断，形成钝性末端的断裂。在真核细胞中，Cas9切断双链DNA后，细胞可自主产生同源重组（homologous recombination，HR）或者非同源末端连接（Non-homologous End Joining, NHEJ）两种机制修复受损DNA，产生插入突变、移码突变、基因敲入等。

sgRNA 和Cas9 基因和sgRNA编码DNA可位于同一个或不同质粒中，在相应启动子的调控下，在细胞内表达。此外，sgRNA也可以通过体外转录合成，与Cas9质粒共转化宿主细胞。

在CRISPR-Cas9技术发明以前，细菌的基因敲除主要依靠基于同源重组技术。这种技术存在效率低下，操作过程复杂，需要耗费长的时间筛选阳性克隆等缺点。研究表明，与上述同源重组技术相比，CRISPR-Cas9 技术具有以下有点：1）效率高，CRISPR-Cas9 技术敲除目的基因是同源重组技术的1000倍；2）可采用同一个CRISPR-Cas9 载体同时或先后对多个靶点进行敲除3）操作简便，只需要根据靶基因设计一条或者两条sgRNA，并将sgRNA的编码DNA克隆入载体，然后转化细菌即可实现基因敲除。

然而，由于绝大部分细菌不具备自主的非同源末端链接系统，Cas9蛋白切割细菌基因组DNA造成的DSB将直接导致细菌死亡，基因敲除操作也随之失败。因此，现有技术中，为避免细菌死亡，需要同时通过电穿孔转化向细菌内导入与靶序列具有高度同源性的线性双链DNA，从而增加了操作步骤和费用。由于构建同源线性双链DNA需要经过多次PCR并连接PCR产物，进一步增加了操作步骤和费用。因此，现有技术的CRISPR-Cas9系统存在操作繁琐、操作难度大、基因敲除效率仍然不够高的缺点。

发明内容

本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供一种pCr-NHEJ载体，该pCr-NHEJ载体能够用于细菌基因敲除，具有基因敲除效率高的优点。

本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供一种pCr-NHEJ载体的构建方法，该pCr-NHEJ载体的构建方法具有操作简单、操作难度低的优点。

本发明的目的之三在于针对现有技术的不足，提供pCr-NHEJ载体用于细菌基因定点敲除的应用。

为了实现上述目的之一，本发明采用如下技术方案：

提供一种pCr-NHEJ载体，所述pCr-NHEJ载体的序列具有SEQ ID NO: 1所示的序列。

为了实现上述目的之二，本发明采用如下技术方案：

提供上述所述一种pCr-NHEJ载体在定点敲除细菌基因中的应用。

为了实现上述目的之三，本发明采用如下技术方案：