[发明专利]一种pCr-NHEJ载体及其构建方法及其用于细菌基因定点敲除的应用

权利要求书

1.一种pCr-NHEJ载体，其特征在于：所述pCr-NHEJ载体的序列具有SEQ ID NO: 1所示的序列。

2.权利要求1所述的一种pCr-NHEJ载体在定点敲除细菌基因中的应用。

3.权利要求1所述的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）采用革兰阴性菌的广宿主质粒_PBBR1MCS-2（GI:773412）作为基础载体；

（2）采用带有用于mRNA转录的原核启动子PLtetO-1的上游引物和下游引物分别扩增如下三个蛋白基因：cas9（GI:674296984）、ku（GI:444893469）和ligD（GI:444893469），分别得到cas9扩增产物、ku扩增产物和ligD扩增产物；其中，cas9、ku和ligD三个蛋白基因的开放读码框均位于独立的PLtetO-1下游，以便使cas9、ku和ligD三个蛋白基因的表达均受该启动子的调控；所述cas9扩增产物、所述ku扩增产物和所述ligD扩增产物之间带有15nt的碱基重叠；

（3）所述cas9扩增产物的3’端与所述ku扩增产物的5’端，所述ku扩增产物的3’端与所述ligD扩增产物3’端之间，均带有15nt的碱基重叠，通过in-fusion PCR连接所述cas9扩增产物、所述ku扩增产物和所述ligD扩增产物，得到第一连接物；

（4）用限制性核酸内切酶KpnI和HindIII进行双酶切基础载体_PBBR1MCS-2，得到基础载体的酶切产物；所述酶切产物经凝胶电泳、切胶并采用DNA回收试剂盒纯化酶切产物；然后采用in-fusion PCR连接所述纯化后的酶切产物和第一连接物，得到载体pNHEJ；

（5）利用NotI和SpeI双酶切所述载体pNHEJ，得到载体pNHEJ的酶切产物；

（6）向所述载体pNHEJ中同时引入相邻的两个倒置的BsaI酶切位点和相邻的两个倒置的BsmAI酶切位点，用于转录形成能够同时结合目的基因两个位置的sgRNA；其中，带有相邻的两个倒置的BsaI酶切位点的DNA片段为DBsaI，带有相邻的两个倒置的BsmAI酶切位点的DNA片段为DBsmAI；

（7）通过in-fusion PCR将DBsaI、DBsmAI进行链接，得到第二连接产物；

（8）通过in-fusion PCR将所述第二连接产物和载体pNHEJ的酶切产物连接起来，获得用于敲除靶基因的CRISPR-Cas9系统，即pCr-NHEJ载体。

4.根据权利要求3所述的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中，采用具有SEQ ID NO: 2所示序列的引物PPLtetO-1-cas9U和具有SEQ ID NO: 3所示序列的引物PCas9D扩增所述cas9蛋白基因，得到cas9扩增产物；

采用具有SEQ ID NO: 4所示序列的引物PPLtetO-1-KuU和具有SEQ ID NO: 5所示序列的引物PkuD扩增所述ku蛋白基因，得到ku扩增产物；

采用具有SEQ ID NO: 6所示序列的引物PLtetO-1-ligDU和具有SEQ ID NO: 7所示序列的引物PligDD扩增所述ligD蛋白基因，得到ligD扩增产物。