[发明专利]微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法。

背景技术

γ-内酰胺酶(γ-lactamses，EC 3.5.2.-)是催化酰胺类化合物酰胺键水解的一种新型酰胺酶。(+)γ-内酰胺酶能够高效率动力学拆分外消旋体γ-内酰胺，获得光学纯的(-)γ-内酰胺。光学纯的(-)γ-内酰胺是制备抗病毒药物的手性中间体，是抗艾滋病药物(-)阿巴卡韦和(-)卡巴韦的合成原料，也是抗流感药物帕拉米韦的合成原料。此外，γ-内酰胺酶催化外消旋体γ-内酰胺还可获得不同构型的γ-氨基丁酸类似物(GABA)。GABA是一种抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，具有很高的生理活性[1]。人们在发现(+)γ-内酰胺酶之前，一般采用不对称合成的方法制备光学纯的(-)γ-内酰胺，此方法的缺点是原料昂贵、工艺繁琐、生产成本高、造成环境污染，不利于工业化生产[2]。运用γ-内酰胺酶进行工业化生产(-)γ-内酰胺，具有反应条件温和、工艺简单、生产成本低、环境友好、产物光学纯度高等优点。目前对微生物发酵生产γ-内酰胺酶的研究处于γ-内酰胺酶产生菌种的选育和产酶条件优化[3～5]、酶学性质以及相关基因克隆阶段[6～8]，且主要集中于中温γ-内酰胺酶，目前国内外还未见微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的相关研究报道，微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶具有广阔的开发潜力和应用前景。

参考文献：

[1]王建军,郑国钧,吴胜.微生物来源的γ-内酰胺酶的研究进展.微生物学报,2010；

[2]Velazquez F.,Olivo HF.The application ofchiraloxazolidinethiones and thiazolidine-thioned in asymmetric synthesis.Current Organic Chemistry,2002；

[3]Taylor S J C,Sutherland A G,Lee C,et al.Chemoenzymatic synthesis of(-)-carbovir utilizing a whole cell catalysed resolution of 2-azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-one[J].Journal ofthe Chemical Society：Chemical Communications,1990；

[4]李海泉,苏磊,杨柳,等.产γ-内酰胺水解酶菌种的筛选及发酵条件研究.微生物学报,2006；

[5]陈红干,倪晔,孙志浩.高产(+)γ-内酰胺酶菌种的筛选与发酵产酶研究中国生物工程杂志,2012；

[6]Janjun Wang,Xiaoyan Guo,Guojun Zheng.Purification and characterization of an novel(-)gamma-lactamase from Microbacterium hydrocarbonoxydans Annals ofMicrobiology,2009；

[7]Xiaoxi Qin,Jianjun Wang,Guojun Zheng,et al.Enantioselective Resolution ofγ-Lactam by a Whole Cell of Microbacterium hydrocarbonoxydans(L29-9)Immobilized in Polymer of PVA-Alginate-Boric Acid[J].Appl Biochem Biotechnol,2010；

[8]Yang M,Gao Q,Wu S,et al.Characterization of a recombinant(-)γ-lactamase from Microbacterium hydrocarbonoxydans.Biotechnology Letters,2012。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法，该方法是将能产生γ-内酰胺酶菌种先活化，再经过低温驯化，最后于10～16℃下液体发酵生产低温γ-内酰胺酶，这种生产方法获得的低温γ-内酰胺酶经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。本发明所述的一种微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法具体包括以下步骤：