[发明专利]微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法

权利要求书

1.一种微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将能产生γ-内酰胺酶菌种先活化，再逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃→25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，当菌种在低温环境中稳定生长即驯化结束；该菌种的低温驯化培养基组成为：酵母膏0.2～5.0g，N-乙酰-L-苯丙氨酸1.0～10.0g，NH₄Cl2.0～15.0g，Na₂HPO₄0.1～1.0g，NaH₂PO₄0.1～1.0g，MgSO₄0.05～0.5g，琼脂粉20g，自来水1.0L，pH为6.0～8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；

所述的能产生γ-内酰胺酶菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种编号：1.219或1.758或1.1830；

(2)按常规方法将步骤(1)中低温驯化后的γ-内酰胺酶产生菌在液体种子培养基中于10～16℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；所述的液体种子培养基：酵母膏20.0～25.0g，蛋白胨10.0～20g，NaCl 10.0～15.0g，MgSO₄0.05～0.5g，ZnSO₄·7H₂O 2.4～8.0mg，自来水1.0L，pH为6.0～8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；

(3)将液体二级种子按发酵液体积的3～9％接种量接入液体产酶培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶结束；所述的液体产酶培养基：牛肉膏10.0～25.0g，蛋白胨2.0～20.0g，乙酰胺5.0～20g，Tween800.1～0.4g，(NH₄)₂SO₄1.0～1.5g，KH₂PO₄1.4～2.0g，MgSO₄0.1～0.4g，CaCl₂0.2～0.3g，ZnSO₄·7H₂O 2.4～8.0mg，自来水1.0L，pH为5.0～8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；

(4)将步骤(3)的发酵液在4000～8000rpm离心收集菌体，超声破碎，收集到的上清液即为粗酶液；

(5)根据不同需要和使用对象不同，还可以将步骤(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。

2.根据权利要求1所述的一种微生物发酵生产低温γ-内酰胺酶的方法，其特征在于，步骤(1)产生γ-内酰胺酶菌种的活化培养基为：酵母膏20.0g，蛋白胨10.0g，NaCl10.0g，琼脂20.0g，自来水1.0L，pH7.4，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min。