[发明专利]一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的DNA片段及表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，是一种利用毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶DNA片段及表达方法。

背景技术

饲料中大量添加亚治疗量的抗生素和促生长剂，造成了动物耐药性的产生。由于这种多抗性、顽固病菌的出现，使传统抗生素面临巨大挑战。面对未来，必须开拓全新路径，从自然界中寻求具有抗菌消炎、增强免疫力的活性物质作为替代品已成为人们日益关心的问题。我国著名的微生物学专家魏曦说过：“光辉的抗生素之后的时代将是光辉的生态制剂时代”。溶菌酶是被认为替代抗生素的最有前途的产品。

溶菌酶(lysozyme)又称脆壁质酶或N-乙酰壁质聚糖水解酶，能降解细菌细胞壁中N-乙酞胞壁酸和N-乙酞氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，从而破坏细胞壁，使得细菌由于渗透溶解而死亡。对溶菌酶的研究首先是从尼科辽(Nicolle)1907年发表枯草芽孢杆菌溶解因子的报告开始的。两年后，拉希琴科(Laschtscbenko)指出，鸡蛋清有强抑菌作用，是酶作用的结果。1922年，弗来明(Fleming)发现人的鼻涕、唾液、眼泪也有强力的溶菌活性，因其具有溶菌作用，被命名为溶菌酶。溶菌酶广泛存在于动物、植物和微生物中，在动物体内主要存在于唾液、组织液和鸡蛋清中，而在蛋清中溶菌酶约占总蛋白的3.5％，是目前溶菌酶制剂的主要来源之一。作为一种天然的抗菌剂，溶菌酶无毒、无害、安全性高，故在食品领域受到广泛关注。

根据溶菌酶氨基酸序列和底物的差异，可以将溶菌酶大致分为3种类型：c型(鸡蛋清溶菌酶)、g型(鹅蛋清溶菌酶)和噬菌体溶菌酶。迄今为止，生产上应用最多的是鸡蛋清溶菌酶(hen egg white lsozyme)。鸡蛋清中溶菌酶的含量很丰富，约占蛋清总蛋白的3.4％-3.5％，作为溶菌酶类的典型代表，是结构了解最清楚的溶菌酶之一。它含有129个氨基酸，分子量约为14,300Da，鸡蛋清溶菌酶具有的广谱抗性使其在食品和医学等领域早已得到广泛地应用。溶菌酶制剂能有效防止球虫病，饲喂小麦基础日粮的鸡，添加和不添加酶对球虫病的应激呈现不同的反应，对照组鸡生长被抑制52.5％，而加酶组为30.5％，而且损伤系数要好得多。此外，溶菌酶还能改变肠道微生物群，增加肠道有益菌，使肠道内的胺、甲酚等有害物减少，增加机体抗病力，提高动物的生产性能。在不用任何抗生素情况下，于肉鸡饲料中添加饲用溶菌酶制剂，可促进鸡体的健康，增加体重和饲料报酬，减少死亡。饲用溶菌酶可以促进饲料中营养物质的消化、吸收，提高饲料的消化率，最大限度地提高饲料原料的利用率。

目前，我国主要采用蛋厂鸡蛋壳中残留的鸡蛋清为原料来生产鸡蛋清溶菌酶，其中相关的报道很多，有直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、沉淀法、双水相萃取、超滤法等。各种方法优缺点不一，产品的质量和生产成本也有所不同。溶菌酶制备材料相当有限、来源极其困难，因原料来源受限和分离纯化成本较高限制了其应用，无法进行工业化生产，难于满足越来越大的市场需求，因此寻找其他廉价的生产鸡蛋清溶菌酶的途径是非常有意义的，近年来人们正研究利用分子生物技术构建基因工程菌，通过发酵手段生产溶菌酶，将是提高溶菌酶产量，降低成本的有效手段之一。

发明内容

本发明的目的正是为了克服传统方法的不足，而提供一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，本方法利用基因合成技术直接获得鸡蛋清溶菌酶的cDNA序列，应用真核毕赤酵母表达系统，构建含有相关基因的重组毕赤酵母工程菌株，在甲醇的诱导下实现鸡蛋清溶菌酶在胞外的高效表达。此方法不受原材料来源的限制，不仅能增加该溶菌酶基因的拷贝数，提高酶的表达量和活性，还简化了后期分离纯化工艺，实现了鸡蛋清溶菌酶的大批量工业化生产。

本发明解决其技术问题：

一种DNA序列，其中编码鸡蛋清溶菌酶信号肽的DNA段是根据毕赤酵母密码子偏爱性优化合成，优化后的DNA序列如序列表1所示；

上述利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，具体方法包括以下几个步骤：

(1)获取鸡蛋清溶菌酶基因lyz：根据Gene Bank中已发表的编码具有鸡蛋清溶菌酶蛋白活性的多肽氨基酸序列，合成了鸡蛋清溶菌酶的cDNA序列，并根据毕赤酵母表达宿主进行了密码子的优化，多肽氨基酸序列如序列表2所示；

(2)重组质粒的构建：用酶切连接的方法分别将上述目的基因lyz与表达载体pPIC9K相连，得到携带目的基因的重组表达载体pPIC9K-lyz，并进行双酶切验证；

(3)基因工程菌株的构建：将上述验证正确的重组表达载体转化宿主菌株GS115中，得到含有重组质粒的基因工程菌株；