[发明专利]一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的DNA片段及表达方法

权利要求书

1.一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的DNA序列，其特征是，其中编码鸡蛋清溶菌酶信号肽的DNA段是根据毕赤酵母密码子偏爱性优化合成，优化后的DNA序列如序列表1所示。

2.一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，其特征是，包括以下几个步骤：

(1)获取鸡蛋清溶菌酶基因lyz：根据Gene Bank中已发表的编码具有鸡蛋清溶菌酶蛋白活性的多肽氨基酸序列，合成了鸡蛋清溶菌酶的cDNA序列，并根据毕赤酵母表达宿主进行了密码子的优化，多肽氨基酸序列如序列表2所示；

(2)重组质粒的构建：用酶切连接的方法分别将上述目的基因lyz与表达载体pPIC9K相连，得到携带目的基因的重组表达载体pPIC9K-lyz，并进行双酶切验证；

(3)基因工程菌株的构建：将上述验证正确的重组表达载体转化宿主菌株GS115中，得到含有重组质粒的基因工程菌株；

(4)高拷贝重组子的筛选和鉴定：利用氨基糖苷类抗生素G418浓度梯度进行高拷贝重组子的筛选，再用菌落PCR方法进一步筛选及鉴定高拷贝抗性菌株；

(5)重组鸡蛋清溶菌酶的高效表达：利用甲醇诱导重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶。

3.根据权利要求2所述的一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，其特征在于：方法中所用的真核表达载体是毕赤酵母表达载体pPIC9K，表达宿主细胞是毕赤酵母GS115菌株。

4.根据权利要求2所述的一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，其特征在于：基因工程菌株的构建方法中所用的内切酶为EcoRⅠ和NotⅠ，50μL酶切体系为：

5.根据权利要求2所述的一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，其特征在于：基因工程菌株的构建方法中所10μL连接体系为：

6.根据权利要求2所述的一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，其特征在于，重组工程菌株GS115/pPIC9K-lyz的筛选步骤为：

将重组pPIC9k-lyz质粒经SacⅠ酶切线性化后，用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内，通过0-4.0mg/mL氨基糖苷类抗生素G418压力筛选4mg/mL G418的转化子被筛出，经PCR检测鸡蛋清溶菌酶基因稳定整合到毕赤酵母菌染色体上，挑取拷贝数高的转化子进行His⁺Mut⁺表型筛选，将最终筛选到的多拷贝转化子命名为GS115/pPIC9k-lyz，简称鸡蛋清溶菌酶基因工程菌。

7.根据权利要求2所述的一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，其特征在于重组鸡蛋清溶菌酶的高效表达工艺为：

取GS115/pPIC9K-lyz单菌落，将酵母菌株GS115/pPIC9K、重组酵母菌株GS115/pPIC9K-lyz单克隆分别接种至30ml YPD培养基(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)，27-32℃，180-220r/min培养18-24h，按质量百分比10-12％的接种量分别接种至30ml BMGY培养基中，其pH 5.0-6.5，27-32℃，180-220r/min培养至OD₆₀₀＝2.0-6.0，室温，2500-4000r/min离心细胞5-10min；弃去上清液，用30ml初始pH值为3.0-6.5的BMMY培养基重悬细胞沉淀，以0.5-3.0％甲醇，27-32℃，180-220r/min，诱导表达72-96h后，取诱导菌液1.0mL，4℃，12000r/min离心2-5min，将菌液上清保存于-20℃待用，将诱导的上清进行SDS-PAGE蛋白电泳鉴定。

8.根据权利要求2所述的一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，其特征在于，所用YPD培养基成分为10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，余量为蒸馏水；BMGY培养基成分为10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，pH 5.0-6.5的100mmol/L PBS缓冲液，13.4g/L YNB(酵母氮源碱)，4×10^-4g/L生物素，5g/L甘油，余量为蒸馏水；BMMY培养基成分为10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，pH3.0-6.5的100mmol/L PBS缓冲液，13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，5.0-30mL/L甲醇，余量为蒸馏水。