[发明专利]基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒及其方法。

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指由于转换、颠换、插入、缺失等原因，使不同个体在基因组DNA某特定核苷酸位置上存在不同种类碱基的多态性。SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。位于编码区内的SNP(coding SNP，cSNP)比较少，但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP(synonymous cSNP)，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP(non-synonymous cSNP)，指碱基序列的改变可使以其为模板翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。可通过研究SNP的性状，判定疾病的类型。

研究发现，SNP与许多疾病相关，决定了人类疾病的易感性和药物反应的差异性。SNP对群体遗传学、制药业、法医学、癌症及遗传性疾病甚至进化的研究都将产生不可估量的影响。通过研究SNP图谱，可以更深刻地认识癌症、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病等发病率高的多基因疾病的发生机制。

分子信标(molecular beacon)是一种在5’和3’末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对， 因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。在这种结构下，荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，所以不会产生荧光。在高温变性或之后的退火杂交过程中，这种结构被破坏，导致荧光基团远离淬灭基团，荧光便能被激发和探测到。

目前检测SNP的方法主要有限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态(SSCP)、等位基因特异的寡核苷酸(ASO)杂交、基因芯片、探针法、焦磷酸法、直接测序法等。这些技术检测的样本都要求提取纯化的DNA作为模板，而不能直接加入细胞进行反应，提取纯化的DNA，增加了抽取血液和提取血液DNA的步骤。从抽血到提取纯化DNA至少需要4个小时；并且限制性片段长度多态性、单链构象多态、等位基因特异的寡核苷酸杂交、基因芯片、焦磷酸法、直接测序法等技术操作时需要多个步骤，操作复杂，耗时耗力，检测周期至少需要一周时间。

目前用于临床检测SNP的方法多用探针法，利用分子信标标记提取纯化的DNA，检测SNP的性状，从而判定疾病的类型，但是，提取纯化的DNA作为模板，检测一次最快也要8个小时，检测的效率低，难以满足指导临床用药的快速诊断。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种监测效率高、方便临床用药的快速诊断基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒及其检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案:基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒，包括PCR反应混合液，PCR反应混合液原料包括DNA聚合酶、dNTPs、上游引物、下游引物、突变型分子信标、野生型分子信标、MgCl₂、PCR缓冲液和细胞裂解液。

采用本发明技术方案的基因单核苷酸多态性位点快速检测试剂盒，本PCR混合液中的PCR缓冲液有助于酶的稳定，是给聚合酶提供一个最适合的 催化反应条件；

dNTP是deoxy-ribonucleoside triphosphate(脱氧核糖核苷三磷酸)的缩写，dNTPs则是由四种脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dTTP、dCTP)以相同的比例混合而成，是DNA复制的原料；

MgCl₂的作用是提供Mg²⁺与dNTP以及DNA模板结合形成复合体，只有这种复合体才能被DNA聚合酶识别；

DNA聚合酶，以DNA为复制模板，从DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。

上游引物、下游引物作为DNA复制的起始点，由于在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上，无法指定起始点，因此，在核酸合成反应时，上游引物、下游引物作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用。