[发明专利]与甘蓝型油菜种皮色泽紧密连锁的分子标记及应用

权利要求书

1.与甘蓝型油菜种皮色泽紧密连锁的分子标记SWUA09-355，具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

2.扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

3.获得权利要求1所述分子标记的方法，包括如下步骤：

(1)甘蓝型油菜黄籽品系GH06和黑籽品系中油821为亲本杂交，后代通过“一粒传法”连续自交9代构建重组自交系为作图群体；

(2)提取两个亲本GH06与ZY821及重组自交系群体叶片基因组DNA；

(3)整合近几年公开发表的甘蓝型油菜的遗传图谱信息，将公开发表的SSR、SRAP、RAPD和IBP引物及根据甘蓝型油菜基因组信息自主开发的SSR引物，利用两个亲本基因组DNA进行扩增，扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、固定、染色和显色后，根据目的条带的分子量大小进行判别，筛选多态性引物；

(4)筛选出的多态性引物对高世代重组自交系群体各株系进行基因型分析，利用作物软件Joinmap 4.0进行遗传连锁图谱的构建，选用“Kosambi’s”作图函数计算标记间的遗传距离，将LOD最小值设为“3.0”，用“Group”命令进行分组；选用“Map”命令构建连锁图谱；QTL分析软件Windows QTL Cartographer 2.5及复合区间作图(Composite interval mapping,CIM)法对重组自交系群体多个环境中的种皮色泽表型数据进行了QTL初级定位和效应检测；进行CIM分析时，选用1cM的步长(walking speed)，按照假定检测10和Zmapqtl模型3，选取参数1000次回归，显著水平0.01，最终将一个影响种皮色泽性状的主效QTL定位在A09连锁群上两个标记SWUA09-30-H081N08.7区间内，针对对该区间加密及标记的筛选最终确定SSR标记SWUA09-355与种皮色泽紧密连锁；扩增该标记的其引物对为SWUA09-355F和SWUA09-355R，该引物对具有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中扩增程序如下：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃复性1min，10个循环，每循环退火温度降低0.5℃；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃复性1min，25个循环；72℃延伸5min。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述扩增反应体系如下：2.5μL 10×含Mg²⁺的Easy Taq PCR缓冲液，10mmol/L的dNTPs 0.5μL，10μmol/L的引物各0.5μL，50～100ng基因组DNA，5U/μL的Easy Taq酶0.25μL，ddH₂O双蒸水补足至25μL。

6.如权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的扩增产物稀释2.5倍后采用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳，上样量2.0μL；10％非变性聚丙烯酰胺凝胶包括10％聚丙烯酰胺、0.04％过硫酸铵、0.1％TEMED；电泳缓冲液为0.5×TBE，250V电泳1h；电泳完成后用硝酸银染色显带。