[发明专利]一种榆树枯萎病菌的分子检测方法

权利要求书

1.一种榆树枯萎病菌的分子检测方法，其特征在于：以待测样品DNA为模板，以通用引物ITS1-F/ITS4-B进行巢式PCR的第一轮反应，以第一轮反应产物为模板，以引物OpF和引物OpR为特异性引物，进行巢式PCR的第二轮反应，反应产物进行电泳检测，电泳图中出现304bp条带即为检测出榆树枯萎病菌，否则未检出；其中，引物OpF序列为：5'-GCCCGCCACTGGTTTTGA-3'；引物OpR序列为：5'-CCGCCCGAACCTTTTCCA-3'。

2.根据权利要求1所述的榆树枯萎病菌的分子检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）取0.5g冷冻过的菌丝，放于2mL的平底离心管内，加入2颗直径为3mm钢珠，关上管盖置于研磨仪上，30f/min，研磨3min，取出钢珠，加入500μL CTAB，于液氮内冷冻2min，再放于75℃水浴锅内融化2分钟，重复两次，最后一次于75℃水浴锅内融化30min，接着加入500μL的25:24:1的酚：氯仿：异戊醇，上下颠倒混匀，12000rpm离心10min，取上清，加入2倍体积的预冷无水乙醇沉淀1h，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤，自然风干，50μL ddH₂O溶解DNA，-20℃保存备用；

（2）巢式PCR反应，巢式PCR第一轮PCR反应的引物为通用引物ITS1-F/ITS4-B，PCR反应总体积为25μL，包含1μL基因组DNA，10μM的上下游引物各1μL，2.5μL 10×PCR buffer，2μL 25mM的MgCl₂，2.5μL dNTP，1.25U Taq DNA聚合酶，14.75μL ddH₂O；PCR反应程序为：预扩增95℃ 180s，接着94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 60s，30个循环，最后在72℃延伸10min；巢式PCR第二轮反应以特异性引物OpF/OpR为引物，巢式PCR第一轮PCR产物稀释50倍，取2uL作为第二轮反应模板，PCR反应体系与第一轮相同，PCR反应条件为：预扩增95℃ 180s，接着94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 60s，30个循环，最后在72℃延伸10min；

（3）取巢式PCR产物进行琼脂凝胶电泳检测，电泳图中出现304bp条带即为检测出榆树枯萎病菌。

3.根据权利要求1所述的榆树枯萎病菌的分子检测方法，其特征在于：步骤（1）中，在进行菌丝DNA提取时，当DNA溶于100uL TE溶液后，再次加入200uL CTAB重复提取一次。