[发明专利]一种具有启动子功能的DNA片段与应用

说明书

本发明公开了一种具有启动子功能的DNA片段与应用，所述DNA片段为如下任一序列：(a)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或者其互补序列；(b)对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO:1相同的作为启动子功能的核苷酸序列或者其互补序列；(c)对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列添加一个或多个核糖体结合位点的序列。该DNA具有启动子功能，具有很强的表达活性，在不需要添加诱导物的条件下即能实现外源基因的高表达，将其运用于耐热β‑半乳糖苷酶和转谷氨酰胺酶的表达。特别为解淀粉芽孢杆菌外源基因的表达提供了有效的工具。

技术领域

本发明涉及一种DNA片段，具体涉及一种具有启动子功能的DNA片段以及它的用途。

背景技术

解淀粉芽孢杆菌是一种在农业、医药和食品工业都有广泛用途的重要的工业微生物生产菌株之一。目前在解淀粉芽孢杆菌中高效生产高附加值的重组酶仍有许多限制，其中缺乏高效转录的启动子、可以控制的启动子，具有特征的启动子是限制基因高效表达的主要限制因素。启动子是基因表达的重要组成元件，是RNA聚合酶结合开始转录合成mRNA的地方，启动子与RNA聚合酶的结合效率是影响酶基因表达的关键。不同于大肠杆菌，研究表明枯草菌属含有丰富的σ因子(12种)，RNA聚合酶与启动子的特异性结合取决于σ因子，给在枯草菌属中搜寻高效的启动子带来了难度。

目前报道用于枯草菌属表达重组蛋白的有三类启动子，首先是诱导型启动子。Pspac(杂合启动子，来源于枯草芽孢杆菌噬菌体SPO-1与大肠杆菌lac操纵子的融合)需要添加IPTG诱导，其弱点是启动效率不强需要改进。Pxyl启动子需要木糖作为诱导物，最初运用于枯草芽孢杆菌中，现在也运用于巨大芽孢杆菌的蛋白表达系统，通过加添0.1-2％的木糖，启动子效率上调200倍。PcitM来源于枯草芽孢杆菌，只需要添加2mM柠檬酸盐作为诱导物就可以合成大量蛋白；PsacB用于生产一系列降解酶包括胞内水解酶,胞外分泌酶果聚糖蔗糖酶，碱性蛋白水解酶等。Ptet用四环素作为诱导，Geissendorfer和Hillen将其成功用于生产葡糖脱氢酶和人单链尿激酶。基于glycine riboswitch特点构建利用甘氨酸作为诱导物的启动子体系。其次是与生长阶段相关的启动子类型。比如rpsF基因启动子，编码S6和S18核糖体蛋白,单链DNA锚定蛋白，在对数生长阶段被激活。Nijland等利用rpsF基因启动子在产气荚膜杆菌中大量生产β-类毒素。aprE编码枯草杆菌蛋白酶，其基因启动子在生长稳定期被激活，属于sigA因子类型的启动子，启动强度高。Jan等利用该启动子的单拷贝重组蛋白整合枯草芽孢杆菌基因组中可以获得10％的总蛋白量。最后是自诱导启动子。Ppst启动子可以在磷酸盐饥饿状态的情况下表达上调5000倍。Kerovuo利用Ppst启动子获得2.9g/L植酸酶占胞外总蛋白的65％。PgsiB属于sigB因子类型的启动子，其特点是其mRNA有很长的半衰期达到20min，是应对压力时被诱导，比如温度压力，盐浓度压力，pH压力或者乙醇压力。基于lysine riboswirch特点的启动子(与glycine riboswitch相反)在细胞质中存在大量的赖氨酸时转录终止。

而解淀粉芽孢杆菌的启动子的挖掘和应用和其它芽孢杆菌属相比就非常少了。非专利文献Marcus Schallme et al.(Developments in the use of Bacillus speciesfor industrial production.Canadian Journal of Microbiology[J].2004,50:1-17.)报道利用解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子用于表达胞外α-淀粉酶具有明显的热稳定性并用于糖化作用中，其缺点在于α-淀粉酶启动子的活性还需要进一步提高。专利文献王正祥(王正祥.一种β-葡聚糖酶的高效制备方法.CN201110001750[P].2006.)报道将源于地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶启动子和来源于解淀粉芽孢杆菌的中温α-淀粉酶启动子组合成杂合启动子成功产业化生产β-葡聚糖酶，该杂合启动子具有一定的偏好性。因此，需要挖掘更多优良性状的不同启动子运用于工业化生产中。

发明内容