[发明专利]应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，尤其是涉及一种应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切方法。

背景技术

癌基因的表达是由多个功能转录元件(transcription elements,TEs)结合位点的组合所调控的，这些转录调控元件结合在癌基因启动子序列中的特殊位点上(transcription factor binding sites，TFBSs)，起着调控转录的重要作用。DNase I内切酶可以灵敏地识别全基因组染色质中开放区域，能预测出肿瘤细胞中与肿瘤基因表达相关的功能调控元件(如启动子、增强子、沉默子以及绝缘子等)在基因组上的特异结合位点。

目前DNase-seq技术只在国外应用，并未在国内推广，并且该方法也只是用于细胞样本中，对于调控元件结合位点的研究也只限于细胞水平，没有很好的应用于临床。没有对临床样本的DNase I最佳酶切方法。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切方法，该方法包括以下步骤：

(1)组织样本前处理：

无菌条件下，取组织样本加预冷的含有蛋白抑制剂的PBS洗涤剂洗涤3次；所述的PBS洗涤剂中蛋白抑制剂cocktail(单位为100X)的含量为1X(即稀释至一倍)，所述的蛋白抑制剂具体由AEBSF、EDTA、Leupeptin及Pepstatin  A组成。

(2)组织匀浆研磨收集细胞核：

经过前处理的组织样本中加入NEHB溶液和1.15wt％的KCL，用组织研磨器，在冰浴中研磨后，25000rpm的转速30分钟超速离心收集细胞核；

所述的NEHB溶液具体包括：10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、25mM KCl、0.15mM精胺、0.5mM亚精胺、1mM EDTA、2M蔗糖、10v/v％甘油、10mM NaF、1mM原钒酸盐、1mM苯甲基磺酰氟、0.5mM二硫苏糖醇以及1X蛋白酶抑制剂cocktail，其pH为7.9。

(3)脱氧核糖核酸酶I酶切反应： 

将细胞核用PBS洗涤2次后，悬浮在预冷的酶切消化缓冲液A(具体包括：15mM Tris-Cl、15mM NaCl、60mM KCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA，其pH为8.0)中，37℃水浴2分钟，加入脱氧核糖核酸酶I(DNase I酶，0-60U不等)，37℃酶切5分钟后，加入与脱氧核糖核酸酶I等量的酶切终止液(含有10mM Tris与5mM EDTA，pH为7.6)；

(4)纯化提取酶切DNA：

步骤(3)所得液中加入4ul核糖核酸酶(RNase酶)，55℃孵育15分钟，再加2ul 20mg/ml的蛋白酶K，55℃孵育2小时，用纯化液(体积比25:24:1的酚、氯仿与异戊醇的混合液)抽提DNA片段；

(5)胶回收DNA片段：

将抽提的DNA片段放置在2wt％的琼脂糖胶中，80V，1小时电泳，切胶回收150bp以下的DNA片段；

(6)方法有效性评估：

用实时定量PCR方法检验DNase I的酶切效率。 

(7)DNA-seq文库构建与测序：

文库按照illumina公司的建库试剂盒说明书构建，将建好文库进行Hiseq2000的50SE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明对组织的细胞核的前期收集方法进行改进，并通过细胞核的数量，优化酶切反应条件，提高了DNase I的酶切效率；其次，采用DNase I的梯度 酶切方法与高通量方法的结合，不仅能够有效的获取正确的染色质片段，而且能够降低由于前期研磨样本产生的假阳性，能够在精准定位转录调控元件在全基因组上的结合位点，提高了临床样本的研究进程。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

采取临床肺腺癌组织样本。具体方法如下：