[发明专利]一种提高氧化葡萄糖酸杆菌同源重组效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高氧化葡萄糖酸杆菌同源重组效率的方法，属于基因工程领域。

背景技术

氧化葡萄糖酸杆菌是维生素C经典两步发酵法的生产菌株之一，也是目前维生素C一步发酵法研究最具潜力的菌株。为了探究该菌维C相关代谢网络及有效利用各种代谢工程，基因工程等手段改造氧化葡萄糖酸杆菌，尤其是基因组改造，同源重组效率不可忽视。传统的基因工程模式菌株，如大肠杆菌，酿酒酵母，同源重组效率都很高。而氧化葡萄糖酸杆菌的同源重组效率非常低下，严重阻碍了对氧化葡萄糖酸杆菌基因组水平的改造。

Red重组酶系统来源于λ噬菌体，包括Exo、Beta、Gam三种蛋白，各蛋白协同作用可指导同源重组过程。本发明将外源Red重组酶引入氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans WSH-003)，得到重组菌G.oxydans WSH-003/Red，并转入同源片段进行同源重组。经验证，G.oxydans WSH-003/Red重组效率相比野生菌有了极大提高。此外，本发明以片段作为同源臂供体，利用外源重组酶辅助氧化葡萄糖酸杆菌同源重组改造。证明外源Red重组酶参与并有效促进了氧化葡萄糖酸杆菌的同源重组过程，并且以片段作为同源臂供体相对于质粒载体更加简化。这对氧化葡萄糖酸杆菌甚至葡萄糖酸杆菌属基因组改造都均有重要意义。

发明内容

本发明要解决的第一个问题是提供一种同源重组效率提高的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌，是表达了外源Red重组酶。

在本发明的一种实施方式中，编码所述Red重组酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，将携带编码Red重组酶的重组载体pKD46转入氧化葡萄糖酸杆菌，获得所述氧化葡萄糖酸杆菌工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体pKD46的构建是以质粒pINT-ts为载体，通过酶切连接的方法，将来源于噬菌体的γ、β、exo三个基因置于ParaB启动子控制之下。具体参见One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA,2000Jun 6；97(12):6640-5.DatsenkoKA,WannerBL。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建所述同源重组效率提高的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌的方法，是将编码Red重组酶的基因连接表达载体后转入氧化葡萄糖酸杆菌。

在本发明的一种实施方式中，是将携带编码Red重组酶的重组载体pKD46通过电转化方法导入氧化葡萄糖酸杆菌。

所述电转条件：1800V电场强度，200Ω电阻和25μF电容。电转后涂布于氨苄青霉素抗性山梨醇培养基平板，通过控制培养温度(30℃)和抗性浓度(50μg/ml)筛选重组菌G.oxydans WSH-003/Red。

所述山梨醇培养基(g/L)：山梨醇15，酵母粉1.0，pH 4.8～5.1，琼脂20(固体培养基)，121℃灭菌15min。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种应用所述同源重组效率提高的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌进行同源重组(敲除)的方法，所述方法主要包括(1)分别截取目标基因序列上游800-1000bp和下游800-1000bp作为上游同源臂和下游同源臂，(2)设计引入酶切位点的融合PCR引物，扩增并融合上下游同源臂，(3)标记基因通过酶切连接插入上下游同源臂之间，构建得到重组用的同源片段，(4)将同源片段转化氧化葡萄糖酸杆菌工程菌，利用标记基因筛选得到目标菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述标记基因包括卡那基因(kana)和胞嘧啶脱氨酶基因(codBA)，分别来自质粒pBBRMCS-2和大肠杆菌(E.coli K12)基因组。

目前用于氧化葡萄糖酸杆菌大规模基因同源重组的手段极其有限，本发明提供的提高氧化葡萄糖酸杆菌同源重组效率的方法，将为利用同源重组进行多基因敲除或整合提供有效途径。此外，现有氧化葡萄糖酸杆菌同源重组主要是基于载体利用野生菌本身的重组系统进行同源重组，本发明通过外源引入同源重组酶并采用同源片段进行同源重组，简化了质粒构建过程，有效提高了同源重组效率。

附图说明

图1为同源片段构建过程