[发明专利]使用纳米孔和复合部分的核酸分子检测

说明书

背景技术

可以使用例如基于热循环的方法(例如聚合酶链反应(PCR))或等温方法(例如环介导的等温扩增)来扩增核酸分子。可在核酸分子扩增的同时或之后检测扩增产物。这可以允许鉴定感兴趣的核酸序列，如单核苷酸多态性(SNP)、序列突变(包括例如缺失、插入、复制和易位)、罕见核酸分子/序列和样品中其他感兴趣的序列。此外，可以使用核酸扩增来制备用于核酸测序的核酸分子。

发明内容

尽管目前存在可用于核酸扩增和序列鉴定的方法和系统，但各种限制与这类方法相关联。一些核酸序列鉴定方法是昂贵的，并且可能不会在预期应用所需的时间框架内和/或准确度下足够快速地生成序列信息。在此认识到对能够进行序列鉴定的用于鉴定核酸扩增反应产物的改进方法存在需求。

本公开内容提供了用于容易地测定生物样品中靶核酸序列或分子的存在或不存在的系统和方法。

本公开内容的一方面提供了一种在具有或疑似具有靶核酸分子的样品中测定靶核酸分子的存在的方法，该靶核酸分子与复合部分偶联。所述方法包括(a)促使样品流过邻近或靠近电极而设置的膜中的至少一个纳米孔，该电极适于在具有与所述复合部分偶联的靶核酸分子的复合物移动穿过所述至少一个纳米孔时检测电流或其变化，其中所述移动花费的停留时间长于当靶核酸分子不与所述复合部分偶联时，靶核酸分子移动穿过所述至少一个纳米孔所花费的停留时间；以及(b)在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔时，用所述电极测量电流或其变化；以及(c)在没有获得靶核酸分子的核酸序列的情况下，从(b)中测得的电流或其变化检测所述样品中的所述复合物，从而测定所述样品中靶核酸分子的存在。

另一方面提供了一种在具有或疑似具有靶核酸分子的样品中测定靶核酸分子的存在的方法，该靶核酸分子与除聚合酶之外的蛋白质偶联。所述方法包括(a)促使样品流过邻近或靠近电极而设置的膜中的至少一个纳米孔，该电极适于在具有与所述蛋白质偶联的靶核酸分子的复合物移动穿过所述至少一个纳米孔时检测电流或其变化，其中所述移动花费的停留时间长于当靶核酸分子不与所述蛋白质偶联时，靶核酸分子移动穿过所述至少一个纳米孔所花费的停留时间；以及(b)在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔时，用所述电极测量电流或其变化；以及(c)根据(b)中测得的电流或其变化检测所述样品中的所述复合物，从而测定所述样品中靶核酸分子的存在。

另一方面提供了一种在具有或疑似具有靶核酸分子的样品中测定靶核酸分子的存在的方法，该靶核酸分子在使得酶不具有酶促活性的条件下与该酶偶联。所述方法包括(a)促使样品流过邻近或靠近电极而设置的膜中的至少一个纳米孔，该电极适于在具有与所述酶偶联的靶核酸分子的复合物移动穿过所述至少一个纳米孔时检测电流或其变化，其中所述移动花费的停留时间长于当靶核酸分子不与所述酶偶联时，靶核酸分子移动穿过所述至少一个纳米孔所花费的停留时间；以及(b)在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔时，用所述电极测量电流或其变化；以及(c)根据(b)中测得的电流或其变化检测所述样品中的所述复合物，从而测定所述样品中靶核酸分子的存在。在一些实施方案中，所述条件选自样品的盐浓度和样品的温度。在一些实施方案中，该盐浓度包括Mg²⁺的浓度。在一些实施方案中，该浓度小于1摩尔/升(M)。在一些实施方案中，该浓度小于0.1M。在一些实施方案中，该浓度小于0.01M。在一些实施方案中，该浓度小于0.001M。

在一些实施方案中，所述复合部分、蛋白质或酶与所述膜偶联。在一些实施方案中，所述复合部分、蛋白质或酶与所述膜共价偶联。

在一些实施方案中，所述复合部分、蛋白质或酶与所述纳米孔偶联。在一些实施方案中，所述复合部分、蛋白质或酶与所述纳米孔共价偶联。

在一些实施方案中，所述复合部分是蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是内切核酸酶或外切核酸酶。在一些实施方案中，该蛋白质与靶核酸分子结合的结合强度大于针对任何其他核酸分子的结合强度。

在一些实施方案中，所述复合部分是引物。在一些实施方案中，该引物是通用引物。

在一些实施方案中，所述样品包含复合物。在一些实施方案中，所述样品具有小于1M的Mg²⁺浓度。在一些实施方案中，该浓度小于0.1M。在一些实施方案中，该浓度小于0.01M。在一些实施方案中，该浓度小于0.001M。

在一些实施方案中，所述复合部分、蛋白质或酶与靶核酸分子可逆地偶联。在一些实施方案中，所述复合部分、蛋白质或酶在施加电场和/或压力脉冲后可从靶核酸分子上移除。