[发明专利]使用纳米孔和复合部分的核酸分子检测

权利要求书

1.一种在具有或疑似具有靶核酸分子的样品中测定所述靶核酸分子的存在的方法，所述靶核酸分子与复合部分偶联，所述方法包括：

(a)促使所述样品流过邻近或靠近电极而设置的膜中的至少一个纳米孔，该电极适于在具有与所述复合部分偶联的所述靶核酸分子的复合物移动穿过所述至少一个纳米孔时检测电流或其变化，其中所述移动花费的停留时间长于当所述靶核酸分子不与所述复合部分偶联时，所述靶核酸分子移动穿过所述至少一个纳米孔所花费的停留时间；以及

(b)在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔时，用所述电极测量所述电流或其变化；以及

(c)在没有获得所述靶核酸分子的核酸序列的情况下，根据(b)中测得的所述电流或其变化检测所述样品中的所述复合物，从而测定所述样品中所述靶核酸分子的存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合部分与所述膜偶联。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述复合部分与所述膜共价偶联。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合部分与所述纳米孔偶联。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述复合部分与所述纳米孔共价偶联。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合部分是蛋白质。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述蛋白质是内切核酸酶或外切核酸酶。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述蛋白质与所述靶核酸分子结合的结合强度大于针对任何其他核酸分子的结合强度。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合部分是引物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述引物是通用引物。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包含所述复合物。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品具有小于1摩尔/升(M)的Mg²⁺浓度。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述浓度小于0.1M。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述浓度小于0.01M。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述浓度小于0.001M。

16.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在(a)之前，(i)提供反应混合物，其包含具有或疑似具有模板核酸分子作为所述靶核酸分子的前体的生物样品，与所述模板核酸分子互补的至少一种引物，和聚合酶，以及(ii)在产生所述样品中的所述靶核酸分子的条件下使所述反应混合物经历核酸扩增反应。

17.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括在所述核酸扩增反应期间或之后提供所述复合部分。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述样品包含所述靶核酸分子。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述靶核酸分子是作为所述核酸扩增反应的扩增产物的多个拷贝中的拷贝。

20.根据权利要求16所述的方法，其中所述引物具有一个或多个限制酶切位点或针对所述复合部分的结合位点。

21.根据权利要求16所述的方法，其中所述核酸扩增反应是聚合酶链反应(PCR)。

22.根据权利要求16所述的方法，其中所述核酸扩增反应是等温扩增。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述等温扩增是环介导的等温扩增(LAMP)。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述至少一种引物包括至少两种引物。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合部分与所述靶核酸分子特异性结合。

26.根据权利要求1所述的方法，其中(b)包括测量电流变化，该变化指示所述复合物的存在。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述电流变化是电流相对于时间的一阶导数。

28.根据权利要求1所述的方法，其中在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔之后测量所述电流。