[发明专利]从复杂样品中分离微生物的方法

说明书

本发明涉及从包含哺乳动物细胞的样品中分离以及任选地检测微生物的方法，所 述方法包括使用包含Benzonase?核酸酶的裂解缓冲液。本发明还涉及包含Benzonase?核 酸酶的裂解缓冲液及其用途。

微生物负载监测与及时结果对于重组蛋白或来自生物反应器的其它生物技术产 物的生产期间中的质量控制而言至关重要。

生物反应器样品的生物负载水平通常由膜过滤和后续在培养基或贫瘠平板（poor plating）上的温育确定。由于生物反应器样品的颗粒含量，尤其是当生物反应器中存在高 水平的哺乳动物细胞时，仅少量样品可被过滤（1ml至2ml或甚至更少），这需要多个过滤 步骤以能够对每个样品的代表性体积进行测试。

可以通过添加用于分离哺乳动物细胞和微生物的差速离心步骤来改进此方法。在 这种情况下，将含有微生物的上清液在膜上过滤并在培养基上温育。此方法的缺点在于一 些可能被哺乳动物细胞捕获或粘附的污染物有可能丢失。

出于诊断目的，需要高样品体积以能够检测低水平污染。不尽如人意的膜过滤性 导致开发出了能够有差别地裂解临床样品的真核细胞而不裂解所包含的微生物的裂解缓 冲液。在裂解缓冲液处理后，过滤样品并将膜在培养基上温育。在一些情况下，分子方法可 用于更快地检测微生物。在这种情况下，需要在裂解真核细胞后应用特定的处理以移除高 含量的可能干扰检测方法的真核生物DNA。在后续步骤中，裂解微生物以释放其DNA。纯化此 DNA并随后通过分子方法（如PCR或实时PCR）检测。由于许多人工处理步骤，所以全部这些步 骤的组合是耗时而费力的。

在现有技术中，描述了通过选择性裂解哺乳动物细胞而分离和检测哺乳动物细胞 样品的微生物污染的解决方案。这些出版物涉及在临床样品（如体液，特别是血液）中检测 微生物污染。

例如，WO2009/015484A1公开了通过选择性裂解血细胞同时使用皂苷制剂保护 微生物细胞，从血液中分离和检测微生物和微生物核酸的快速方法。

在WO2011/070507A1中，通过将样品在碱性条件下于非离子型去垢剂中温育而 实现对样品中血细胞的选择性裂解。

US2008/0131955A1描述了从体液样品中混合的DNA分离靶DNA的方法，其涉及选 择性裂解哺乳动物细胞的步骤。

EP0745849A2公开了处理全血以用于样品中可能存在的微生物的核酸分析的方 法，其中红细胞经过了选择性裂解。

然而，具有大体积和高细胞密度的复杂生物反应器样品依然给检测微生物污染造 成了挑战。因此，本发明的目的是开发在包含哺乳动物细胞的复杂样品中分离和/或检测微 生物污染的方法。

在第一个方面，本发明涉及从包含哺乳动物细胞的样品中分离微生物的方法，其 包括

a)使样品与包含Benzonase?核酸酶的裂解缓冲液接触，

b)通过移除哺乳动物细胞而获得微生物。

在第二个方面，本发明涉及从包含哺乳动物细胞的样品中分离和检测微生物的方 法，包括

a)使样品与包含Benzonase?核酸酶的裂解缓冲液接触，

b)通过移除哺乳动物细胞而获得微生物，

c)对微生物进行通用裂解，

d)实施特定的或通用的检测方法以检测微生物。

根据本发明的方法提供了若干优点：

－快速分析大样品体积（最多至50ml；在小于20min内分离细菌）、

－以良好的灵敏度在具有大量哺乳动物细胞（总体最多至5*10⁸个细胞）的样品中检 测微生物、

－简单而有限的人工操作。

包含哺乳动物细胞的样品可以是其中疑似或可能疑似有微生物存在和/或生长的 任何临床或非临床样品，以及那些被定期或偶尔测试微生物存在的材料的样品。样品可以 是新鲜的或冷冻的样品。在优选的实施方案中，样品为生物反应器样品。

根据本发明可以考虑任何种类的生物反应器。

可以通过本领域技术人员已知的任何方法（例如通过将少量细胞培养物转移至容 器中）从生物反应器获得样品。容器可以是适用于本方法的任何管或反应容器。

通常，样品中哺乳动物细胞的数量为至少10⁶个细胞。在优选的实施方案中，样品 中哺乳动物细胞的数量为至少10⁷个细胞。