[发明专利]通过使用邻近条形编码分析分子复合物的概况的方法

说明书

本发明涉及用于通过用分子构建体的至少一个集合标记属于相同复合物的分子而研究个别分子复合物的组分的方法，其中所述集合的各成员包含独特标识序列(UIS)和至少一个共同标签序列(CTS)，所述独特标识序列是对于所述集合的各成员独特的核酸序列，所述共同标签序列是所述集合的所有成员共同的核酸序列，所述方法通过以下实现：‑通过将所述分子构建体连接或杂交至所述复合物的核酸分子、或将所述标签连接或杂交至与特异性结合至所述复合物的组分的亲和结合剂连接的核酸而将所述分子构建体连接至所述复合物，‑通过在核酸聚合反应中使用所述分子构建体标签作为引物或模板而标记属于所述相同复合物的分子，和‑通过分析UIS和CTS的组合来分析所述分子复合物的组成。

发明领域

本发明涉及分子生物学方法，并且尤其涉及研究分子诸如DNA、RNA和蛋白的复合物或研究单细胞中的这些分子的方法。

发明背景

目前存在几种可用于研究分子复合物(例如蛋白复合物、蛋白-DNA复合物)的技术。共-免疫沉淀(共-IP)使用不同的捕获抗体和检测抗体来分析相互作用蛋白复合物。邻近连接测定(PLA)或邻近延伸测定(PEA)使用以下理念：仅当两个或更多个亲和探针结合至相邻或相互作用蛋白时，使抗体上缀合的结合的DNA寡核苷酸邻近，且因此允许酶促连接或延伸和形成新的可扩增的报告DNA分子。在染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)中，使用抗体来捕获具有其结合的DNA片段的目标蛋白。然后将DNA片段测序以揭示蛋白在染色质上结合的位置。

当在分子水平研究生物调节时，这些方法已经提供了有用知识。然而，所有这些方法都具有不能鉴定和定量来自各个别复合物的所有组分、特别是分析所述复合物的概况的限制。例如，Chip-seq能够揭示蛋白结合至染色质的位置，但它无法揭示两个或更多个蛋白是否同时结合至染色质上的相同区域。

对于单细胞研究，流式细胞仪允许细胞流过细通道和以高达几千个细胞/秒的速度逐个检测来自单细胞的信号。为了平行分析几种蛋白，不同抗体可以用不同荧光团标记。然而，当同时检测许多荧光信号时，可以出现光谱重叠。为了避免该问题，质谱流式细胞仪(mass cytometer)，通过使用质量同位素来标记抗体，可以最小信号重叠分析多于30种蛋白。然而，多重容量(multiplexing capacity)在基于流的测量中仍然受限，并且它们还不适合于核酸分析。一种针对单细胞实现高度多重分析的方式是通过将细胞分选入分离的反应孔中，且分别分析各单细胞的组分。例如，在单细胞RNA-Seq中，手动或在自动化帮助下将单细胞分选至单一孔中，所述自动化例如，荧光活化细胞分选(FACS)，随后细胞裂解，逆转录(RT)和测序具有样品条形码的文库制备物。然后，可以将不同细胞的条码编码产物合并在一起且通过下一代测序(NGS)进行测序。通过该程序，可能分析几百个细胞，但分选许多单细胞，例如多于10 000个单细胞且个别进行随后的文库制备仍然是非常费力的。甚至使用自动化系统，如C1™单细胞自动制备系统，制备许多细胞的测序文库仍然是困难的任务。

WO2012/042374目的在于提供用于使用具有独特序列的核酸分子标签测定样品中的分子的数目或浓度的方法。

Hindson等人, Analytical Chemistry, 2011, 83, 8604-8610公开了用于DNA拷贝数的绝对定量的高通量液滴数字系统。

WO2012/048341目的在于提供用于高通量单细胞分析的方法和组合物。所述方法和组合物可用于基因组和转录组分析，以及抗体发现、HLA分型、单体型分析和药物发现。

Binladen等人(PLoS ONE 2(2):e197)使用用59-核苷酸标签化的引物的常规PCR以便从多个样本生成同源DNA扩增产物，随后通过高通量DNA测序系统进行测序。随后通过59标签分析将各DNA序列回溯至其个别来源。