[发明专利]用于制备DNA文库的DNA接头分子以及生产它们的方法和用途

说明书

本发明涉及用于制备DNA文库的DNA接头分子以及生产它们的方法和它们的用途。本发明可用于分子生物学中的应用，特别是用于下一代测序(Next Generation Sequencing)和/或文库复用(Library Multiplexing)。本发明公开了包含双链多核苷酸分子的DNA接头分子，其中第一链的5’末端被修饰成使得没有用于激酶的结合位点，所述第一链的3’末端被修饰成不能发生连接，反向链的5’末端被修饰成使得没有用于激酶的结合位点，并且所述反向链的3’末端以游离羟基为特点(在最后一个核苷酸的3’位置处)。

技术领域

本发明涉及用于制备DNA文库的DNA接头分子以及生产它们的方法和它们的用途。本发明可用于分子生物学中的应用，特别是用于下一代测序(Next GenerationSequencing)和/或文库复用(Library Multiplexing)。

背景技术

下一代测序(NGS)是用于确定DNA或RNA序列的核碱基序列的现代技术。NGS的优点(速度、经济效益、准确性)导致它在应对遗传信息的分析及其执行的所有学术机构中的占有率不断增长。几个全球性公司提供NGS解决方案，包括Roche、Life Technologies和Illumina。

为了在一次运行中对大量样品进行测序，可以将已知序列的条形码添加到确定样品并用于在测序后将序列指派到样品。

用于多路测序(同时对大量不同样品进行测序)的方法、组合物和试剂盒公开在WO2011156529 A2中。在一个反应室中对来自于两个或更多不同样品的多个靶多核苷酸进行测序并且通过条形码鉴定每个被测序的靶多核苷酸所源自的样品。

另一份公开了具有提高的样品通量的测序方法的文献是WO 2008061193 A2。其中将接头序列(被称为标签序列)连接到样品，随后将样品混合并测序。

WO 2013033721 A1公开了为多路DNA测序优化条形码设计的方法。

US 2013059762 A1提供了可用于样品中存在的一种或多种核酸的多路PCR的方法、组合物、试剂盒、系统和装置。具体来说，提供了各种不同的靶特异性引物，其允许选择性扩增一个或多个靶序列。因此，在平末端连接反应中将接头连接到靶序列。

在用于下一代测序(NGS)的DNA文库的制备期间，在大多数情况下通过物理或化学方法将高分子dsDNA片段化，并将特异性针对测序平台的接头序列连接到产生的DNA分子。一般来说，接头序列含有用于引物的结合位点，并可能含有条形码序列，其允许在混合物中测序多个带条形码的DNA文库(多路)并随后将关于相应条形码的测序信息指派到原始样品。

在可以进行这种接头序列与片段的连接之前，必须修复在片段化期间随机且不可预见地形成的DNA末端。通过聚合酶将突出的3’末端切除并将突出的5’末端填补成双链。随后，通过激酶将片段的5’末端磷酸化。随后，将在一侧是平末端以允许在那里连接并且在另一侧具有3’突出端以避免在那里连接的未磷酸化的DNA接头，在连接酶帮助下连接到产生的DNA分子。由于未磷酸化的接头序列的连接不在接头的5’末端处导致磷酸二酯键的形成，因此在连接后在DNA双链中留下缺口，失去的磷酸二酯键随后需要用能够进行缺口平移的酶封闭。

常用的接头序列不能被添加到末端修复混合物，这是因为末端修复混合物中的酶将修饰它们，使得连接的方向性丢失，并且将形成接头二聚体和寡聚体。

发明目的

本发明的目的是改良接头序列以使它们可以在文库制备开始时已被添加到片段化的DNA。本发明的另一个目的是避免接头二聚体和寡聚体的形成。

发明内容

本发明公开了DNA接头分子，其包含双链多核苷酸分子，其中