[发明专利]用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针

说明书

本申请要求于2013年8月9日提交的美国临时申请序列No.61/864.128的优先权权益，通过引用将其全部内容并入本文。

发明背景

1.技术领域

本发明一般性涉及分子生物学领域。更特别地，其涉及核酸的检测。

2.背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是不采用活的生物体对DNA进行酶复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、感染性疾病的诊断、基因克隆、亲子鉴定和DNA计算。由于其无可比拟的复制和精确能力，PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。通常在PCR反应的终点(end-point)或者平台期进行DNA检测，这使得难以对起始模板进行定量。实时PCR或动态PCR通过记录反应过程中的扩增子浓度，从而提高了终点PCR分析的能力。最通常通过与被扩增的靶标有关的荧光信号的改变来记录扩增子浓度。实时PCR相对于终点检测的优势还在于，由于其在封闭的系统中进行，因此限制了污染。其它优势包括更高的灵敏度、动态范围、速度和需要较少的过程。

在实时PCR检测方法中已经采用了几种测定化学。这些测定化学包括采用双链DNA结合染料、双标记的寡核苷酸，例如发夹引物和发夹探针。然而，目前实时PCR的一个缺陷在于其受限的多重性(multiplexing)能力。目前的实时PCR技术采用在溶液中游离的报告荧光染料。在多重反应中，该设计必须在每个测定中采用光谱不同的荧光色素。例如，设计来检测4个靶序列的多重反应将需要能够通过光谱不同来区分4个不同的、游离漂浮的荧光色素的仪器，这还不包括对照。这些要求不仅限制了实际的多重能力，而且增加了成本，其原因在于这样的设备通常需要多个发射源、检测器和滤器。目前的实时PCR技术的多重能力为大约1-6重(plex)。

发明概述

本发明涉及用于DNA扩增和检测的系统和方法。特别是，本发明提供的系统和方法极大地提高了实时核酸扩增(例如经PCR)的多重能力。

在一个实施方案中，提供了用于检测样品中靶核酸存在的方法，其包括：(a)将所述样品与第一引物组接触，所述第一引物组包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团(reporter)；(ii)具有已知熔链点(melt point)的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的序列；(b)用所述第一引物组扩增所述靶核酸，其中在用淬灭基团(quencher)标记的非天然核苷酸的存在下进行所述扩增，所述非天然核苷酸与所述第一引物的非天然核苷酸碱基配对；(c)通过检测所述第一引物上报告基团的信号改变(例如信号淬灭)来检测所述靶核酸分子的存在。

因此，在一个更特定的实施方案中，提供了用于检测样品中第一和第二靶核酸分子的一个或两者之存在的方法，其包括：(a)将所述样品与至少第一和第二引物组接触，每组引物包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的序列，其中所述第一和第二引物组的报告基团相同，并且其中所述第一和第二引物组包含具有可区分熔链点的发夹；(b)用所述第一和第二引物组扩增所述靶核酸(以获得扩增产物)，其中在用淬灭基团标记的非天然核苷酸的存在下进行所述扩增，所述非天然核苷酸与所述第一和第二引物组之第一引物的非天然核苷酸碱基配对；(c)通过检测所述第一或第二引物组之第一引物上的报告基团的信号改变来检测靶核酸分子的存在；以及(d)改变所述样品的温度并确定对应于所述报告基团未淬灭时的熔链点或熔链峰(melt peak)，来确定第一靶核酸分子、第二靶核酸分子或两者的存在是否导致所述报告基团的信号淬灭，由此检测所述第一和第二靶核酸分子的一个或两者的存在(例如，基于所述第一和第二引物组的发夹的可区分熔链点)。

在某些方面，该实施方案中使用的报告基团可以为荧光团，例如连接在所述第一引物5’端的荧光团。因此，在一些情况下，信号的改变可以是荧光信号的降低。在另一方面，检测所述第一引物上报告基团的信号改变还包括与扩增产物杂交，所述扩增产物包含报告基团和淬灭基团(例如暗淬灭基团(dark quencher))。