[发明专利]用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针

权利要求书

1.用于检测靶核酸存在的体外方法，其包括：

(a)将样品与第一探针组接触，所述探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；

(b)延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的镜像标签序列互补的序列，以形成延伸的上游探针；

(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；

(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针中的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及

(e)通过检测所述发夹探针上的所述报告基团-淬灭基团对来检测所述靶核酸。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3至10个碱基的3’序列。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述上游探针包含与所述下游探针的标签序列互补的3至10个碱基的3’序列。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述下游探针还包含(iii)包含一个或更多个非天然碱基的isoprimer互补序列，其位于所述镜像标签序列和与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列之间，所述镜像标签序列与所述上游探针的标签序列具有相同序列。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述上游探针包含与所述下游探针的isoprimer互补序列互补的3至10个碱基的3’序列。

6.如权利要求1所述的方法，其中在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游探针和所述下游探针的熔链点低于55℃。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述报告基团-淬灭基团对的第一成员为报告基团。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述报告基团为荧光团。

9.如权利要求8所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括检测荧光信号的改变。

10.如权利要求1所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括当样品温度改变时检测所述报告基团-淬灭基团对的信号改变。

11.如权利要求10所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括当样品的温度升高至高于发夹探针的熔链点时检测所述报告基团-淬灭基团对的信号改变。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述下游探针连接固体支持物。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个非天然核苷酸或淬灭基团标记的非天然核苷酸为isoG，另一个为isoC。

14.如权利要求1所述的方法，其还包括：

(a)使所述样品与第二探针组接触，所述第二探针组包含第二上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及第二下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述第二上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述第二上游探针包含与所述第二下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述第二探针组形成T-连接；

(b)延伸所述第二上游探针以合成与所述第二下游探针上的镜像标签序列互补的序列，以形成第二延伸的上游探针；

(c)使所述第二延伸的上游探针与其自身杂交以形成第二发夹探针；

(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述第二发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述第二上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及

(e)通过检测所述第二发夹探针上的所述报告基团-淬灭基团对来检测所述第二靶核酸。