[发明专利]抗体组合物和用于其的缓冲体系

说明书

一种将分离的抗体缀合至标记物或衍生化试剂的方法，所述方法包括：在包含除甘氨酸以外的一元羧酸缓冲化合物(其带有处于在α或β位的氨基取代基)的缓冲体系中，使该抗体与经活化的标记物或经活化的衍生化试剂接触，或者在抗体缀合试剂的存在下使所述抗体与所述标记物或衍生化试剂接触。

技术领域

本发明涉及用于缀合反应中的抗体组合物、抗体分离试剂盒、用于将分离的抗体与标记物缀合的方法以及用于此类组合物、试剂盒或方法的缓冲体系。

背景技术

所有抗体最初均被制成粗制品形式(例如，免疫血清、腹水、杂交瘤组织培养物上清液)。在用于许多基础研究和诊断应用中之前，必须将抗体纯化以除去许多(或全部)污染性非抗体蛋白和小分子(例如，氨基酸)。

如果要将抗体共价连接至“标记物(label)”(例如，酶、有机染料、荧光蛋白或有色颗粒)以产生杂交试剂(通常称作“标记抗体”或“抗体缀合物”)或者连接至衍生化试剂以引入新的官能团，则纯化特别重要。缀合物的抗体部分赋予针对特定抗原(例如，蛋白、药物、肽或生物标志物)的特异性，而标记物则赋予可测量性，以使该缀合物能用于对例如蛋白印迹物、组织切片、培养的细胞、血样和尿液等中的抗原进行检测和定量。

抗体纯化中的关键步骤是抗体与抗原亲和柱或者与带有固定化的蛋白A、蛋白G或蛋白L的柱的结合，所述柱与不直接参与抗原结合的抗体区相互作用。抗原亲和柱上的抗体纯化是有利的，因为粗制样品中的具有不相关抗原特异性的抗体不会保留在柱上。这种亲和纯化方法稳健可靠，且广泛用于从诸如血清、腹水和杂交瘤组织培养物上清液等粗制样品中纯化抗体。

无论使用何种纯化方式，柱结合的抗体通常用低pH缓冲液(通常包含甘氨酸或柠檬酸)洗脱，然后用例如Tris缓冲液(pH 8.0至9.0)快速中和，以使低pH对抗体造成的损害最小化(例如，Thermo Scientific Protein Purification Technical Handbook,ref1601617 07/08)。用低pH甘氨酸或柠檬酸缓冲液进行洗脱被广为采用，因为其成本低且其在破坏抗体-抗原相互作用所需的pH值处具有良好的缓冲能力。

在储存之前，通常(但并非总是)在PBS或某些其它近中性的pH缓冲液中透析中和的纯化抗体。出于稳定化或避免微生物生长的目的，往往会将其它物质(例如，BSA、叠氮化钠、洗涤剂)添加至经透析的抗体。

在从商业来源购买抗体时，极少情况会得到关于纯化过程中所用的透析步骤的信息。因此，可能不清楚来自纯化过程的缓冲剂成分是否留在了最终的抗体制备物中。如果要将抗体标记，则这样的考虑至关重要，因为用于洗脱亲和柱的缓冲剂常常会在标记反应中造成严重干扰。

所有类型的标记物都最通常地与抗体分子上的赖氨酸残基连接。例如，有机荧光染料的NHS酯和流行的荧光素异硫氰酸酯衍生物(FITC)与赖氨酸残基反应。虽然其他缀合化学(例如，巯基-马来酰亚胺)可能并未明显涉及赖氨酸残基，但其几乎总是依赖于在缀合过程早期步骤中的赖氨酸修饰。例如，赖氨酸导向型异双官能NHS酯衍生化试剂常用于将马来酰亚胺和各种其它官能团(例如，受保护的巯基、叠氮基、碘代乙酰基)引入蛋白分子。碳二亚胺用于将抗体缀合至羧基化微米颗粒或纳米颗粒，其涉及表面羧基与抗体中的赖氨酸残基的反应，从而形成酰胺键。

为人熟知的是，涉及赖氨酸残基的衍生化或缀合反应不能在含伯氨基的物质(例如，游离氨基酸)的存在下进行。这是因为这类物质会与蛋白中的赖氨酸残基竞争。在碳二亚胺介导的反应(其涉及羧基与氨基的偶合)的情形中，现有技术的教导因竞争问题而强烈反对使用具有羧基或伯氨基官能团的添加剂。

因此，流行的抗体洗脱缓冲剂在几乎所有类型的抗体标记方法中都是禁忌的。甘氨酸或柠檬酸都不能出现在抗体与标记物的受碳二亚胺介导的反应中，因为该反应涉及氨基与羧基的缩合。