[发明专利]双重聚糖结合AAV载体的方法和组合物

说明书

本发明提供了包含腺伴随病毒（AAV）衣壳蛋白的方法和组合物，所述AAV衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，其中所述取代将新的聚糖结合位点引入AAV衣壳蛋白内。

优先权声明

本申请根据35 U.S.C. § 119（e）要求于2013年3月15日提交的美国临时申请序列号61/802,111的权益，所述美国临时申请的完整内容通过引用并入本文。

政府支持声明

本发明根据由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）授予的授权号R01HL089221、P01HL112761和R01AI072176在政府支持下进行。美国政府在本发明中拥有一定权利。

发明领域

本发明涉及来自腺伴随病毒（AAV）的经修饰的衣壳蛋白、包含其的病毒衣壳和病毒载体及其使用方法。

发明背景

病毒-聚糖相互作用是宿主细胞侵入的关键决定因素。细胞表面碳水化合物例如唾液酸、神经节苷脂或硫酸类肝素由大量病毒采用，所述病毒例如流感、疱疹病毒、SV40、多瘤病毒、乳头状瘤病毒及其他病原体^1,2。在大多数情况下，单个类别的聚糖主要充当病毒的细胞表面附着因子，导致其他受体/辅受体的序贯或平行衔接用于细胞进入。腺伴随病毒（AAV）是辅助依赖性细小病毒，其采用硫酸类肝素（HS）、半乳糖（Gal）或唾液酸（Sia）作为细胞表面结合的主要受体^3,4。例如，AAV血清型2和3b利用HS；AAV1、4和5以不同连接特异性结合Sia，而AAV9采用Gal用于宿主细胞附着。不同的AAV毒株还需要与辅受体的后续相互作用用于细胞摄取，所述辅受体例如整联蛋白αVβ5或α5β1、成纤维细胞生长因子受体（FGFR）、血小板来源的生长因子受体（PDGFR）、表皮生长因子受体（EGFR）、肝细胞生长因子受体（HGFR）或层粘连蛋白受体 ^3,4。

特定AAV毒株和单个类别的碳水化合物之间的单配关系的显著例外是AAV血清型6，其识别Sia和HS⁵。然而，仅Sia已显示是病毒转导必需的。结构研究目前已确定在AAV6衣壳的VP3亚基中与R488、K528和K533结合的K531残基构成HS葡萄氨基葡聚糖的静电识别的连续基本片(patch)^6-8。类似地，通过AAV2和AAV3b的HS识别的结构基础是众所周知的，并且归于位于三重对称轴处的碱性氨基酸残基的相似簇^9-12。AAV1、AAV4、AAV5和AAV6的Sia结合足迹（binding footprint）仍有待确定。最近以来，涉及通过AAV9衣壳的Gal识别的关键氨基酸残基通过使用分子对接和定点诱变的组合进行鉴定¹³。需要的是具有多重聚糖结合能力的病毒载体，以采用替代途径用于细胞进入和转导。

本发明通过提供具有多重聚糖结合位点的经修饰的衣壳蛋白、包含这些衣壳蛋白的AAV载体和其用作治疗载体的方法，克服了本领域中的前述缺点。

发明概述

在一个方面，本发明提供了包含一个或多个氨基酸取代的腺伴随病毒（AAV）衣壳蛋白，其中所述取代将新的聚糖结合位点引入AAV衣壳蛋白内。在一些实施方案中，氨基酸取代在AAV2中的氨基酸266、氨基酸463-475和氨基酸499-502中，或者AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV10中的相应氨基酸位置中。

在一些实施方案中，新的聚糖结合位点可以是己糖结合位点，其中所述己糖是半乳糖（Gal）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glu）或岩藻糖（fuc）。

在一些实施方案中，新的聚糖结合位点可以是唾液酸（Sia）结合位点，其中所述Sia残基是N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）或N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）。