[发明专利]使用免疫玫瑰花结和磁性粒子分离细胞的方法

说明书

本发明涉及使用免疫玫瑰花结和磁性粒子将靶细胞与非靶细胞分离的方法。所述方法涉及使含有靶细胞和诸如红细胞等次级靶标的样品与抗体组合物接触，所述抗体组合物允许所述靶细胞与所述次级靶标的免疫玫瑰花结形成。随后，使所述样品与第二抗体组合物接触，所述第二抗体组合物允许磁性粒子结合于所形成的免疫玫瑰花结和游离次级靶标。使用磁场将用磁性粒子标记的所述免疫玫瑰花结和次级靶标与非靶细胞分离。所述抗体组合物任选含有双功能抗体或四聚抗体复合物。

本公开的领域

本公开涉及使用免疫玫瑰花结和磁性粒子分离细胞的方法。

背景

在许多应用中，需要富集、或者耗尽生物样品中的某些细胞群。血液学、免疫学以及肿瘤学领域依赖于来自诸如骨髓、脾脏、胸腺以及胎肝等相关组织的外周血和细胞悬浮液的样品。从这些非均质样品中分离特定细胞类型是这些领域中的研究的关键。诸如T细胞和B细胞等免疫细胞的纯化群体是研究免疫功能所必需的，并且用于免疫治疗中。细胞、分子以及生物化学过程的研究需要孤立地分析某些细胞类型。许多技术已用于分离淋巴细胞子集，诸如T细胞、B细胞以及自然杀伤(NK)细胞；以及粒细胞，诸如嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞以及嗜酸性粒细胞。

已基于诸如密度等物理性质以及通过用磁性粒子直接靶向分离了造血细胞和免疫细胞。针对细胞表面抗原的单克隆抗体的出现已极大地扩展了区分和分离不同细胞类型的能力。存在两种使用单克隆抗体从血液和相关细胞悬浮液中分离细胞群体的基本方法。它们在用抗体区分/标记的是需要还是不需要的细胞方面有所不同。在正选择技术中，所需细胞用抗体标记并且从剩余的未标记/不需要的细胞中移出。在负选择中，不需要的细胞被标记并且去除。抗体和补体处理以及使用免疫毒素是负选择技术，而荧光辅助细胞分选(FACS)和大多数批量免疫吸附技术可适合于正选择与负选择两者。在免疫吸附技术中，细胞是用单克隆抗体选择，并且优先结合于可从其余细胞中去除的表面，例如珠粒柱、烧瓶、磁性粒子。免疫吸附技术在临床上和研究中受到欢迎，因为它们保持了用单克隆抗体靶向细胞的高特异性，但是不同于FACS，它们可被放大，以直接处理临床收获物中的大量细胞，并且它们避免了使用诸如免疫毒素等细胞毒性试剂和补体的危险。然而，它们需要使用“装置”或细胞分离表面，诸如珠粒柱、淘洗烧瓶或磁铁。

密度分离常用于将外周血液单核细胞与粒细胞和红细胞分离。Ficoll(GEHealthcare Life Sciences,Chalfont,United Kingdom)是用于此应用的最流行的密度溶液。在Ficoll密度分离中，全血在Ficoll上分层，并且然后离心。红细胞和粒细胞与沉淀物一起沉积，而单核细胞保持在Ficoll:血浆界面处。此技术的成功依赖于单核细胞和粒细胞之间的密度差异。如果全血储存超过24小时，那么粒细胞密度改变并且将不与红细胞一起沉淀。在单次密度分离中不能从细胞密度改变的储存的血液或样品中获得纯单核细胞的悬浮液。RosetteSep是一种可从STEMCELL Technologies Inc.(Vancouver,Canada)商购获得的免疫密度细胞分离产品，其通过在不需要的有核细胞与红细胞之间形成免疫玫瑰花结使用密度梯度离心来从诸如人外周全血等含红细胞的样品中富集细胞。虽然免疫密度细胞分离可从人外周全血有效富集有核细胞群体，但是在最终富集的细胞样品中可能存在残余红细胞污染。关于使用密度梯度离心来分离免疫玫瑰花结的更多信息参见Thomas的美国专利号6,448,075，其以引用的方式并入本文中。