[发明专利]基于环介导等温扩增技术检测苹果锈果类病毒的引物组、试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于环介导等温扩增技术检测苹果锈果类病毒的引物组、试剂盒和方法，属于生物检测试剂技术领域。

背景技术

苹果锈果类病毒(Apple scar skid viroid, ASSVd)归于苹果锈果类病毒属(Apscaviroid)，粒体由330个核苷酸组成。苹果锈果类病毒的侵染寄主是苹果和梨。感病的苹果因品种和环境条件的变化表现出5 种显性病症：锈果型、花脸型、锈果-花脸型、环斑型和绿点型，感病的梨大多数表现为隐性，少数为畸形果。由于类病毒在寄主植物细胞核中复制和累积，在感病寄主的叶、茎、皮、砧木，以及果实的表皮、果肉和种子中均可检测出类病毒。因此，感染类病毒的果树终生带毒，并通过嫁接和修剪工具传染的途径使类病毒病蔓延。许多国家的苹果树和梨树中均发现ASSVd 的危害，我国东北、西北、华北，以及江苏、安徽、山西和山东等地亦有发生。目前尚未有苹果锈果类病毒的恒温扩增方面的检测技术的发明报道。因此，建立苹果锈果类病毒的新型检测鉴定方法，对于提高苹果锈果类病毒的检疫检验效率、防止苹果锈果类病毒的传入、传出，保护我国农业的安全生产，促进我国农产品的顺利出口，具有十分重要的意义。植物类病毒由于不显性侵染比较普遍，症状表现受环境温度的影响较大，而且几种鉴别植物对不同类病毒的反应症状相似，故难于应用生物测定的方法。由于类病毒不能产生任何蛋白质，所以也不能使用检测病毒的电镜、血清学方法。因此，选用分子生物学方法对苹果锈果类病毒进行检测。

在现有的核酸检测方法中，常用的有聚合酶链式反应（常规PCR和实时荧光PCR），该方法灵敏、特异，但需要高品质热循环仪，而且因为温度循环导致较长。其他新开发的核酸扩增方法，比如NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）、3SR(self-sustained sequence replication)、SDA（strand displacement amplification）等，在扩增循环，都有各自的创新点。NASBA和3SR使用一系列转录和反转录过程来循环以避免高温变性作用，SDA则使用限制性内切酶和修饰过的模板来循环扩增。虽然它们的敏感性都很高，可以检测并扩增小于10个拷贝的核酸样本，但是它们还有各自需要克服的缺点。技术要求、材料要求、技术本身特异性缺陷等方面严重束缚了这些技术的推广应用。因此，有必要提供一种更便捷，检测灵敏度更高的检测苹果锈果类病毒的方法。

发明内容

本发明的要解决的技术问题的是提供一种用于检测苹果锈果类病毒的环介导等温扩增的引物组、试剂盒和检测方法，即利用环介导等温扩增方法检测苹果锈果类病毒的引物和试剂盒，本发明可以克服其他检测方法在病毒检测的局限性，为苹果锈果类病毒的检测提供有效工具，能够快速、特异性强、灵敏度高而且低成本的检测苹果锈果类病毒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供的苹果锈果类病毒RT-LAMP检测引物组，包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，它们的碱基序列分别为SEQ ID NO:1～4。

本发明提供的检测试剂盒，包含如下组分：

1）环介导等温扩增反应液A：

包含2×RT-LAMP Mix 12.5 μL、AMV-Bst混合液1.5 μL、RNase-Free Water 2.8 μL、RT-LAMP检测引物组6.2 μL，FIP和BIP各2.5 μL、终浓度均为1μM；F3和B3 引物各0.6 μL，终浓度均为0.25 μΜ;引物F3、B3、FIP和BIP分别具有序列表SEQ ID NO:1～4的碱基序列；

2）B反应液阳性对照样品：含苹果锈果类病毒RNA模板,作为阳性模板。

3）C反应液空白对照样品： 为去离子水。

4）显色剂 ：为10％的荧光染料SYBR GREEN I。

本发明还提供一种使用以上试剂盒，检测样品中苹果锈果类病毒的方法，依次包括下列步骤：

1）待检样品RNA提取

采取Trizol 法或RNA提取试剂盒抽提RNA模板。

2）苹果锈果类病毒环介导等温扩增

A:在反应管中依次加入待检模板RNA 2 μL和环介导等温扩增反应液A 23 μL，充分混匀。

B:在63 ℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60 min。

C:80 ℃终止反应，5 min取出待检。