[发明专利]一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及检测方法与检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及的是食源性致病菌检测技术领域，是一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌)的核苷酸序列及检测方法与检测试剂盒。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种人畜共患病的病原菌，属于李斯特菌属(Listeria spp.)，在自然界中的广泛存在，当牲畜感染后，通过食物链最后导致人类的感染。据WHO报道，健康人的粪便中单增李斯特菌携带率为0.6％～16％，有70％的人可短期带菌。人类受感染后可导致胃肠炎、败血症、脑膜炎、流产等疾病，其中孕妇、婴儿、老年人及免疫力低下者为易感人群，人类感染单增李斯特菌后有高达20％～30％的致死率。因此，2002年WHO将单增李斯特菌列为仅次于大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌后的第四大重要的食源性致病菌。单增李斯特在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。国际国内食品标准规定食品中致病菌不得检出，为有效控制原菌的发生和扩散，有效控制和预防食品中单增李斯特菌污染至关重要。

目前，单增李斯特菌的检测方法以传统的鉴别培养为基础，通过分离培养、生化反应、溶血试验、动物试验等进行分离鉴定。实验设备要求不高，可操作性强，但检验周期长，需6-7d。一些快速单增李斯特菌检测方法除了ELISA法应用于实际检测外，分子生物学方法大多数处于科学研究阶段，尚未广泛应用。因此单增李斯特菌急需特异性和敏感度高的快速诊断方法。

发明内容

本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及检测方法与检测试剂盒；检测试剂盒具有特异性好、灵敏度高、检测时间短的单核细胞增生李斯特氏菌的特点，提高其检测效率和精确度。

技术方案

一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列，包括1623bp，序列为SEQ ID NO.1所示。

一种检测检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)以步骤(1)所提取的基因组DNA为模板，与特异性引物Lm16、PCR缓冲液、MgCl₂溶液、脱氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶混合配置PCR反应体系，进行PCR反应；

其中特异性引物Lm16为Lm16F：5’-CTGTTCGTCGGTCCGTGGTA-3’，

                    Lm16R：5’-CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3’；

(3)检测PCR产物是否为权利要求1所述的大小为1623bp的单一扩增产物。

以上检测方法的步骤(1)中，提取基因组DNA的方法为分子生物学领域常用方法，各种市售细菌基因组DNA提取试剂盒均可实现相同提取目的。

在本发明种扩增产物的判定原则为PCR反应之后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，若步骤(2)所得PCR反应扩增产物在1623bp位置有对应产物，则判定结果为阳性，若所得PCR产物无扩增条带或在1623bp位置无对应产物，则判定结果为阴性。

进一步地，以上所述的检测检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，步骤(2)中PCR反应体系包括10×PCR buffer，5.0～10.0mM MgCl₂，1.0～2.0mM dNTP，10～20μM引物Lm16F，10～20μM引物Lm16R，1～10ng/μL基因组DNA，0.5～1U Taq DNA聚合酶，双蒸水补齐至25μL；PCR反应过程为：①94℃，3min；②94℃，30s；③60℃，30s；④72℃，75s；步骤②至④循环35次；⑤72℃，10min；⑥4℃保存。

进一步地，以上所述的检测检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，步骤(3)中PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。

一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒，包括特异性引物Lm16、PCR缓冲液、MgCl₂溶液、脱氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶，所述特异性引物Lm16序列如下：

上游引物Lm16F：5’-CTGTTCGTCGGTCCGTGGTA-3’

下游引物Lm16R：5’-CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3’。