[发明专利]产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种特异检测产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌感染的荧光定量PCR检测试剂盒，属于细菌核酸检测领域，适用于临床及科研中对产气荚膜梭菌肠毒素阳性的快速定性定量检测。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种重要的人畜共患病的病原体，广泛存在于环境中的土壤、水源、人和动物肠道中。该菌的致病性主要依据其产生各种毒素的能力，到目前为止，共发现至少15种以上的产气荚膜梭菌毒素，除了分型的四种分型致死性毒素α、β、ε、ι毒素外，其中所有型的产气荚膜梭菌均含有外毒素cpα，还发现了与人和动物疾病有密切关系的重要的新细菌毒素，如肠毒素(clostridium perfringens enterotoxin,CPE)。虽然产肠毒素的产气荚膜梭菌约占产气荚膜梭菌的2～5％，但CPE阳性的产气荚膜梭菌可引起人的食物中毒、抗生素相关腹泻和散发性腹泻等非食源性胃肠疾病及动物胃肠疾病，与食品公共安全息息相关，目前根据国际最新标准，将检测样品中CPE阳性产气荚膜梭菌作为产气荚膜梭菌食物中毒的指标。

已有多种免疫学方法用于检测临床样品中的肠毒素，但是存在有检测的局限性，免疫学检测方法检测的是毒素蛋白，易出现假阴性的检测结果。主要是由于检测的样品如腹泻粪便等肠毒素含量处于较低水平，另一方面由于肠毒素产生于该菌的芽孢阶段，在体外培养时，很难形成芽孢产生肠毒素蛋白，因此按照常规的免疫学检测方法不能从人工培养物中检测到。随着PCR技术的广泛应用，对产气荚膜梭菌的检测从传统方法过渡到以PCR及杂交探针为主的快速检测现代方法，目前根据产气荚膜梭菌的不同毒素建立了多重PCR检测方法，可对产气荚膜梭菌进行检测与分型。虽然PCR方法灵敏度较高，特异性强，但也有一些缺陷，不能够检测极低病毒含量的临床样品，如何改进和提高方法的特异性仍有待进一步的研究。

荧光定量PCR检测技术在普通PCR的基础上又高了一个新的水平，无论敏感性、特异性与检测速度都具有显著优势。但它对引物和探针也提出了更高的要求。产气荚膜梭菌肠毒素cpe有两种基因型，一种是位于细菌染色体上，一种是细菌质粒上。

现有技术关于产气荚膜梭菌抗原、抗体检测及荧光定量PCR技术的文献很少，未涉及到产气荚膜梭菌外毒素cpa和肠毒素cpe的诊断技术。

发明内容

本发明的目的是建立一种利用荧光定量PCR技术特异检测含肠毒素cpe产气荚膜梭菌的荧光定量PCR快速检测试剂盒，该试剂盒能够特异灵敏地检测出产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性菌，从而达到快速诊断的目的。

本发明为解决以上技术问题采用的技术方案是：产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a)荧光定量反应液、b)产气荚膜梭菌外毒素cpa阳性和产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品、c)阴性质控品；其中荧光定量反应液包含有引物2对和探针1对，为产气荚膜梭菌外毒素cpa的上游引物cpa01和下游引物cpa02以及荧光探针cpap；产气荚膜梭菌肠毒素cpe的上游引物cpe01和下游引物cpe02以及荧光探针cpep，其中，

产气荚膜梭菌外毒素cpa的引物序列为：

上游引物cpa01：5’-GATTTGTAAGGCGCTTATTTGT-3’，

下游引物cpa02：5’-ATAGCATGAGTTCCTGTTCCA-3’，

荧光探针cpap：5’-CTACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTG-3’，探针上游5’端标记的荧光报告基因是TAMRA，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ-2；

产气荚膜梭菌肠毒素cpe的引物序列为：

上游引物cpe01：5’-AGTGTAAATTAAGCTTTTGAGTCCA-3’，

下游引物cpe02：5’-TAGCTGCTGCTACAGAAAGATTAA-3’，

荧光探针cpep为5’-AAGGGTATGAGTTAGAAGAACGCCAATCA-3’，探针上游5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ-1。