[发明专利]产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒

权利要求书

1.产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a)荧光定量反应液、b)产气荚膜梭菌外毒素cpa阳性和产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品、c)阴性质控品；其中荧光定量反应液包含有引物2对和探针1对，为产气荚膜梭菌外毒素cpa的上游引物cpa01和下游引物cpa02以及荧光探针cpap；产气荚膜梭菌肠毒素cpe的上游引物cpe01和下游引物cpe02以及荧光探针cpep，其中，

产气荚膜梭菌外毒素cpa的引物序列为：

上游引物cpa01：5’-GATTTGTAAGGCGCTTATTTGT-3’，

下游引物cpa02：5’-ATAGCATGAGTTCCTGTTCCA-3’，

荧光探针cpap：5’-CTACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTG-3’，探针上游5’端标记的荧光报告基因是TAMRA，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ-2；

产气荚膜梭菌肠毒素cpe的引物序列为：

上游引物cpe01：5’-AGTGTAAATTAAGCTTTTGAGTCCA-3’，

下游引物cpe02：5’-TAGCTGCTGCTACAGAAAGATTAA-3’，

荧光探针cpep为5’-AAGGGTATGAGTTAGAAGAACGCCAATCA-3’，探针上游5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ-1。

2.按权利要求1所述的产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于所述的荧光定量反应液由1×PCR buffer(含Mg²⁺)，dNTPs 0.5mM，Taq酶2U，产气荚膜梭菌外毒素cpa的上游引物cpa01和下游引物cpa02各0.4μM，荧光探针cpap为0.4μM，产气荚膜梭菌肠毒素cpe的上游引物cpe01和下游引物cpe02各0.4μM，荧光探针cpep为0.4μM组成。

3.按权利要求1所述的产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于所述的产气荚膜梭菌外毒素cpa阳性和产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品为含有α毒素和cpe序列的克隆质粒，其中产气荚膜梭菌外毒素cpa的阳性质控品为构建的载体pUC57-cpa，其序列为：ATGAA AAGAA AGATT TGTAA GGCGC TTATT TGTGC TACGC TAGCA ACTAG CCTAT GGGCT GGGGC ATCAA CTAAA GTCTA CGCTT GGGAT GGAAA GATTG ATGGA ACAGG AACTC ATGCT ATGAT TG；

产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性质控品为合成的长链构建的载体pUC57-cpe，其序列为AGATA TAGAA AAAGA AATCC TTGAT TTAGC TGCTG CTACA GAAAG ATTAA ATTTA ACTGA TGCAT TAAAC TCAAA TCCAG CTGGT AATTT ATATG ATTGG CGTTC TTCTA ACTCA TACCC TTGGA CTCAA AAGCT TAATT TACAC TTAAC AATTA CAGCT ACTGG ACAAA AATAT AGAAT CTTAG CTAGC AAAAT TGTTG ATTTT AATAT TTATT CAAAT AATTT TAATA ATCTA GTGAA ATT。

4.按权利要求1所述的产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌双重荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于所述的阴性质控品是灭菌的无酶双蒸水。