[发明专利]利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的方法

说明书

技术领域：

本发明属于转基因产品检测领域。具体涉及用于交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的引物组，以及含有该引物组的试剂盒，还涉及利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的方法。

背景技术：

转基因作物(Genetically Modified Organisms，GMO)，是指利用基因工程方法将其他生物的遗传基因转移到作物中而形成的作物。通常转基因技术，可增加作物的产量、改善品质、提高抗旱、抗寒或其它特性。但是，对转基因产品的安全性一直是争议的问题。人们主要有两个忧虑，一是出于健康角度，二是出于生态安全角度。为了保障消费者的知情权和选择权，国内外纷纷出台相应的法律法规要求对转基因食品进行标识。而转基因植物产品快速简便的检测方法的建立是标识转基因产品最直接有效的技术支持。

根癌农杆菌胭脂碱合成酶(Nopaline Synthase，NOS)基因是一种报告基因，在转基因研究过程中可快速报告植株是否被成功转化，NOS基因终止子主要存在于马铃薯、大豆、玉米、甜椒等可能的转基因产品中(刘光明等.食品科学，2005，(5))。已建立的转基因的检测方法有：常规PCR、实时荧光定量PCR、多重PCR、巢式PCR、LAMP方法等(陈碧华等.食品科学，2008:705-712)，但是这些体外核酸扩增技术大多需要与电泳、荧光、质谱法或直接测序等方法结合来进行检测，这些方法大多操作复杂、价格昂贵，而且都是以大型的仪器设备和熟练的专业技能为前提的检测技术，因此，并不适合于基层单位应用。

交叉引物恒温扩增技术(Crossing Priming Isothermal Amplification，CPA)(专利号为：ZL200810134583.1)是杭州优思达生物技术有限公司结合恒温核酸扩增技术和核酸试纸条快速检测技术而发明的一种操作简单、时间短、成本低的检测技术，可广泛用于病原体检测等领域。该技术还具有特异性强、灵敏度高的特点，特别适合用于现场检测。目前该技术结合胶体金核酸试纸条的检测方法已被用在诸如沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌、结核分歧杆菌、恶性疟疾、霍乱弧菌、志贺氏菌、瓜果类斑病菌等病原菌的检测(祁军等.食品研究开发，2013,34(2):67-70；祁军等.中国媒介生物学及控制杂志，2013,24(3):204-207)。

经检索，未发现交叉引物恒温扩增技术在转基因产品检测上应用的报道。

发明内容：

针对目前转基因产品检测领域存在的方法复杂、需要专用设备和专业人员、费时长和成本高等缺点，本发明目的在于提供用于交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的引物组。

本发明另一目的在于提供利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的试剂盒。

本发明第三目的在于提供利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的方法。

实现本发明的技术方案如下：

本发明用于交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的引物组，由一对外围引物、一个交叉扩增引物和一对检测探针引物组成；

其中所述的一对外围引物为：

正向外围引物NOS4s：5’-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3’(SEQ ID No:1)，

反向外围引物NOS5a：5’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3’(SEQ ID No:2)；

所述的交叉引物NOS2a1s：

5’-GTTTATGAGATGGGTTTTTTTTGTTTTCTATCGTGTATTA-3’(SEQ ID No:3)；

所述一对检测探针引物为：

检测探针NOS2a*：5’-GTTTATGAGATGGGTTTTT-3’(SEQ ID No:4)

检测探针NOS3a*：5’-TTAGAGTCCCGCAATTATACA-3’(SEQ ID No:5)；

其中检测探针NOS2a*的5’端标记修饰生物素；检测探针NOS3a*的5’端标记修饰荧光素FAM。

本发明利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的试剂盒，包括下列6个部分，分别为核酸检测试纸条、SSC缓冲液、恒温扩增反应液、Bst DNA聚合酶液、无菌双蒸水和阳性对照。

上述试剂盒中所述的核酸检测试纸条是指3号核酸检测试纸条，可从杭州优思达生物技术有限公司购买。