[发明专利]一种用于检测大肠菌群的试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域，特别涉及一种用于检测大肠菌群的试剂盒及应用。

背景技术

食物的微生物污染是影响食品安全的重要因素之一，在其贮藏与加工过程中，快速、准确地检测食物微生物污染，是控制和保障食品安全的重要手段。目前，对于食品中大肠菌群的检测，国内多数采用的检测方法是依据中华人民共和国国家标准《食品卫生微生物学检验-大肠菌群的快速检测》(GB/T4789.32-2002)。国标法检测结果的准确性、灵敏性均较高，但是操作繁杂、耗时较长，不适合于保质期短的食品检测；尽管快速检测国标法大大缩短了试验周期，操作也相对较易，但仍然需要使用大量玻璃容器和仪器，不便于现场操作。进出口行业标准《食品中大肠菌群和大肠杆菌快速计数法PetrifilmTM测试片法》(SN/T 1896-2007)中的3M试纸快速检测方法由于前处理简单，处理时间短，在生产加工企业的现场检测中具有较大优势，但是其检测效果和检测限量是否达到国家规定的食品卫生标准还有待证实，且造价成本较高，不适应于日常生产生活中大批量的食品抽检。

由于大肠菌群的广泛存在，使得传统检测方法变得繁复且低效，不适应于现代食品检测中快速灵敏的要求。因此研究出一种能够同时检测食品中各种大肠菌群且快速简洁的通用型检测方法迫在眉睫。

目前国内外应用于检测大肠菌群的分子生物学技术，主要分为三类：普通PCR技术、荧光PCR技术和基因芯片技术。基因芯片方法检测效率高，但技术还不成熟，假阳性率和假阴性率都很难控制，而且成本较高，目前还处于研究阶段。普通PCR方法技术成熟，但是，由于检测样品中，微生物种类很多，引物设计是难点，引物特异性不高，容易造成假阳性结果；而且只能定性检测出大肠菌群，而不能定量；再者需要对PCR产物进行后处理，极易导致PCR产物污染。荧光PCR是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，其除了具有普通PCR的优点外，还具有以下优点：(1)特异性更强，灵敏度更高：由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，从而提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度；(2)全封闭反应，在线式实时监测荧光，无须PCR的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因素干扰的终点分析法，使得定量更准确可靠；(3)可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰；(4)不接触有毒试剂，操作安全；(5)有利于规模化、自动化及联网管理；(6)适用范围更广，理论上可检测任何大肠菌群的核酸。但是，荧光定量PCR对引物的要求相对于普通PCR而言，更为苛刻。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于检测大肠菌群的试剂盒。该试剂盒能定量检测大肠菌群。

本发明的另一目的在于提供所述试剂盒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种用于检测大肠菌群的试剂盒，包括引物序列和探针序列；其中：引物序列由上游引物F1130a、上游引物F1130b和下游引物R1264组成；探针序列为探针Pb1156A；

所述的上游引物F1130a的序列为如下所述的任一条序列：核心序列A；或以核心序列A为中心，向5’和3’端分别或同时延伸1～10个核苷酸得到的序列；优选为核心序列A、向核心序列A的5’端延伸10个核苷酸得到的序列或向核心序列A的3’端延伸10个核苷酸得到的序列；

核心序列A：5’-TCCTGCTGATGAAGCAGAACAA-3’；

所述的上游引物F1130b的序列为如下所述的任一条序列：核心序列B；或以核心序列B为中心，向5’和3’端分别或同时延伸1～10个核苷酸得到的序列；优选为核心序列B、向核心序列B的5’端延伸10个核苷酸得到的序列或向核心序列B的3’端延伸10个核苷酸得到的序列；

核心序列B：5’-ATATCGAACTCATGAAGCAGCATAA-3’；

所述的下游引物R1264的序列为如下所述的任一条序列：核心序列C；或以核心序列C为中心，分别或同时向5’端延伸1～10个核苷酸以及向3’端延伸1～2个核苷酸得到的序列；优选为核心序列C、向核心序列C的5’端延伸10个核苷酸得到的序列或向核心序列C的3’端延伸2个核苷酸得到的序列；

核心序列C：5’-CCATGCCGTGGGTTTCAATAT-3’；