[发明专利]一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法。

背景技术

二硫键是由2个巯基被氧化而形成的-S-S-形式的共价键。二硫键分两种，即分子内和分子间二硫键，分子内二硫键存在于单独的多肽链中用来稳固蛋白质的三级结构，而分子间二硫键存在于肽链之间用来稳定蛋白质的四级结构。二硫键的断裂会促使蛋白质的立体结构发生一定程度的改变，进而影响蛋白质的生物特性及反应活性，例如，二硫键的断裂会加速卵清蛋白发生糖基化反应。目前，人类正不断尝试通过某种技术改变蛋白质结构，从而改造其性能。例如，通过超声波技术可以改变牛血清白蛋白结构，进而加速其发生糖基化反应的速率。蛋白质结构的改变是否和二硫键断裂有关？这一问题的回答有利于指导蛋白质功能性质的定向改造，因此，寻找一种能够准确检测蛋白质二硫键是否发生断裂的方法显得十分必要。

本发明采用碘乙酸与蛋白质中的游离巯基反应，通过超滤去除未反应的碘乙酸，再运用二硫苏糖醇断裂蛋白质的二硫键产生新的巯基，采用碘乙酰胺与蛋白质中新产生的巯基反应，运用胰蛋白酶将被碘乙酰胺作用后的蛋白质水解成多肽，借助高分辨率质谱检测多肽的质荷比信息，与天然蛋白质的二硫键信息进行对比，确定二硫键是否发生断裂。本发明采用碘乙酸与蛋白质的游离巯基反应、碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键得到的巯基反应，运用高分辨率质谱进行检测，国内外未有文献进行相关报道。

发明内容

本发明旨在提供一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，采用碘乙酸与蛋白质的游离巯基反应、碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键得到的巯基反应，运用高分辨率质谱进行检测，与天然蛋白质的二硫键信息进行比对，确定二硫键是否发生断裂。

其具体工艺步骤如下：

1、蛋白质游离巯基与碘乙酸反应

（1）蛋白质溶液的配制：用10-100mM的碳酸氢氨溶液溶解得到0.1-2.0 mg/ml的蛋白质溶液；

（2）碘乙酸溶液的配制：用超纯水配制50-150mM的碘乙酸溶液；

（3）蛋白质游离巯基与碘乙酸反应：将10-30μl蛋白质溶液与3-10μl碘乙酸溶液混合，混匀后，避光放置20-60 min；

（4）去除未参与反应的碘乙酸：采用1000-10000Da的超滤离心管去除未参与反应的多余碘乙酸。

2、二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键

（1）二硫苏糖醇溶液配制：用超纯水配制50-150mM的二硫苏糖醇溶液；

（2）二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键：向蛋白质溶液中加入二硫苏糖醇溶液2-10μl，50-100℃处理3-30min，冷却至室温；

3、碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂二硫键得到的巯基反应

（1）碘乙酰胺溶液的配制：用超纯水配制50-150mM的碘乙酰胺溶液；

（2）碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂二硫键得到的巯基反应：向蛋白质溶液中加入碘乙酰胺溶液5-15μl，混匀后，避光放置20-60 min；

4、胰蛋白酶酶解蛋白质

（1）胰蛋白酶的配制：用超纯水配制0.1-1.0mg/ml的胰蛋白酶溶液；

（2）胰蛋白酶酶解蛋白质：按照蛋白质与胰蛋白酶质量比g/g 为100:1-100:1，将胰蛋白酶与蛋白质溶液混合，在30-50℃的摇床中放置8-24h；

（3）中止胰蛋白酶的水解反应：加入1-10%的三氟乙酸2-10μl中止胰蛋白酶的水解反应，得到最终的蛋白质水解混合物。

5、高分辨率质谱检测

（1）上样：将2-15μg的蛋白质水解物注射入高效液相色谱仪，脱盐3-10min；

（2）高分辨率质谱检测：连接高效液相色谱仪和高分辨率质谱设备，采谱30-60min，记录蛋白质水解物的质谱信息；

6、数据分析

（1）质谱图谱分析：整理蛋白质水解产物的质谱信息，碘乙酸与巯基反应会使多肽质量增加57.09-58.02Da，碘乙酰胺与巯基反应会使多肽质量增加57.01-57.03Da；

（2）蛋白质中巯基游离情况分析：根据蛋白质水解物的质荷比增加信息，断定巯基是与碘乙酸发生反应还是与碘乙酰胺发生反应，若与碘乙酸发生反应则说明蛋白质中的巯基是游离的，若与碘乙酰胺发生反应则说明蛋白质中的巯基是结合的，即以二硫键的形式存在；

（3）确定蛋白质中的二硫键是否发生断裂：根据数据库中天然蛋白质的二硫键存在信息，对比实验中得到的二硫键信息，确定蛋白质中的二硫键是否发生断裂。