[发明专利]一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法

权利要求书

1.一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，其特征是：

A、蛋白质游离巯基与碘乙酸反应；

B、二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键；

C、碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂二硫键得到的巯基反应；

D、胰蛋白酶酶解蛋白质；

E、高分辨率质谱检测；

F、数据分析。

2.根据权利要求1所述的一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，其特征是：

所述蛋白质游离巯基与碘乙酸反应包括如下步骤：

（1）用10-100mM的碳酸氢氨溶液溶解得到0.1-2.0mg/ml的蛋白质溶液；

（2）用超纯水配制50-150mM的碘乙酸溶液； 

（3）将10-30μl蛋白质溶液与3-10μl碘乙酸溶液混合，混匀后，避光放置20-60min；

（4）采用1000-10000 Da的超滤离心管去除未参与反应的多余碘乙酸。

3.根据权利要求1所述的一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，其特征是：

所述二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键包括如下步骤：

（1）用超纯水配制50-150mM的二硫苏糖醇溶液；

（2）向蛋白质溶液中加入二硫苏糖醇溶液2-10μl，50-100℃处理3-30min，冷却至室温。

4.根据权利要求1所述的一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，其特征是：

所述碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂二硫键得到的巯基反应包括如下步骤：

（1）用超纯水配制50-150mM的碘乙酰胺溶液；

（2）向蛋白质溶液中加入碘乙酰胺溶液5-15μl，混匀后，避光放置20-60min。

5.根据权利要求1所述的一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，其特征是：

所述胰蛋白酶酶解蛋白质包括如下步骤：

（1）用超纯水配制0.1-1.0mg/ml的胰蛋白酶溶液；

（2）按照蛋白质与胰蛋白酶质量比g/g为 100:1-100:1，将胰蛋白酶与蛋白质溶液混合，在30-50℃的摇床中放置8-24h；

（3）加入1-10%的三氟乙酸2-10μl中止胰蛋白酶的水解反应，得到最终的蛋白质水解混合物。

6.根据权利要求1所述的一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，其特征是：

所述高分辨率质谱检测包括如下步骤：

（1）将2-15μg的蛋白质水解物注射入高效液相色谱仪，脱盐3-10min；

（2）连接高效液相色谱仪和高分辨率质谱设备，采谱30-60min，记录蛋白质水解物的质谱信息。

7.根据权利要求1所述的一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，其特征是：

所述数据分析包括如下步骤：

（1）整理蛋白质水解产物的质谱信息，碘乙酸与巯基反应会使多肽质量增加57.09-58.02Da，碘乙酰胺与巯基反应会使多肽质量增加57.01-57.03Da；

（2）根据蛋白质水解物的质荷比增加信息，断定巯基是与碘乙酸发生反应还是与碘乙酰胺发生反应，若与碘乙酸发生反应则说明蛋白质中的巯基是游离的，若与碘乙酰胺发生反应则说明蛋白质中的巯基是结合的，即以二硫键的形式存在；

（3）根据数据库中天然蛋白质的二硫键存在信息，对比实验中得到的二硫键信息，确定蛋白质中的二硫键是否发生断裂。