[发明专利]耐高糖面包酵母菌株的构建及其选育方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别是一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株及其构建方法。

背景技术：

面包酵母是面包生产过程中重要的微生物发酵剂和疏松剂，同时也是一种生物营养剂，可以增加面团的营养成分。通常情况下，面包酵母被分成两类：一类用于不加糖或糖含量在7％以下的面团中，为低糖面包酵母；另一类用于高糖面团发酵中，为高糖面包酵母。高糖面包酵母主要用于甜面包的制作过程中，甜面包在我国习惯上称为点心面包，其入口香甜而松软，面包内质和外观均质地细腻、组织均匀，形状上花色品种繁多，外观漂亮诱人，给人以美得享受，特别是各种包馅的甜面包更是风格迥异，能满足不同消费者的饮食需求。但是，甜面包的制作，除添加面粉、酵母、盐和水外，还需加入大量的蔗糖(用量高达15％～30％)，此时普通面包酵母的发酵速度就不可避免地受到抑制。一般工业制作上，为了解决这个问题，通常采用加大酵母用量的方法，这无疑会带来一定的负面影响，如面包酵母味较重，生产成本较高等。因此为了保持面包的风味、降低甜面包的制作成本，研究面包酵母对高糖的耐受性具有重要的实际指导意义。

高糖面团中可发酵性碳源主要是蔗糖，其含量可高达25％，由于SUC基因家族的存在，使得酵母可以在以蔗糖为唯一碳源的培养基中生长。但是，在高糖面团中，SUC基因家族水解蔗糖的速度比酵母利用己糖的速度快300多倍，致使细胞在短时间内大量积累由蔗糖酶水解但未被利用的己糖，进而导致酵母周围环境形成较高的渗透压，直接影响细胞的活性，同时过量的葡萄糖积累会引起葡萄糖效应，从而抑制酵母的生长速度和发酵性能，出现面团产气量低、发酵速度缓慢等现象。因此，为了减轻渗透压的抑制作用以及葡萄糖效应，可以通过降低蔗糖转换酶活力来实现，从而提高面包酵母高糖环境下的耐受性。

作为SUC基因家族的一员，蔗糖转换酶基因(SUC2)位于酵母的第Ⅸ条染色体的末端，全长2.7kb，SUC2基因可以编码两种不同形式的蔗糖转换酶：一种存在于胞内的非糖基化形式的转换酶；另一种是分泌型的糖基化形式的转换酶。在蔗糖转换酶的作用下蔗糖水解生成D-葡萄糖和D-果糖，随后葡萄糖和果糖进入糖酵解途径以供酵母利用。

然而，目前对于面包酵母菌株中蔗糖转换酶基因SUC2的研究报道很少，尤其是在选育适合高糖面团发酵的面包酵母菌株的研究更是空白，因此，本发明通过利用调控基因表达水平比SUC2启动子低的VPS8启动子调控出发菌株面包酵母CICC32253中蔗糖编码基因SUC2表达来选育适合高糖面团发酵的面包酵母菌株，可以提高酵母菌株在高糖面团中的发酵力，同时满足了甜面包制作过程中对酵母的较高要求。

发明内容：

本发明所解决的技术问题之一是提供一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株。

所述面包酵母，是通过利用VPS8启动子调控出发菌株中蔗糖编码基因SUC2表达来获得。

所述VPS8启动子核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述酵母出发菌株为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32253。

本发明所解决的另一个技术问题是提供一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)将VPS8启动子序列VPS8p和SUC2启动子的下游序列通过融合PCR连接；

(2)将SUC2启动子的上游序列片段、步骤(1)所得的连接片段及标记基因KanMX片段插入pUC19质粒中，得到重组质粒；

(3)以重组质粒为模板扩增出含有SUC2启动子的上、下游序列、VPS8p序列及标记基因KanMX的重组片段，将重组片段转化入出发菌株的a型和α型单倍体菌株中，得到重组后的基因工程单倍体菌株；

(4)将pGAPza质粒导入所述重组后的基因工程单倍体菌株中，纯化并融合后得到所述基因工程菌。

具体如下：

(1)重组质粒的构建

①以面包酵母CICC32253总DNA为模板，PCR扩增出VPS8启动子序列VPS8p以及SUC2启动子的上、下游序列SUC2p-A(以下简称A)和SUC2p-B(以下简称B)；

②将VPS8p和SUC2启动子的下游序列B片段通过融合RCR得到VPS8p-SUC2p-B片段，以下简称PB片段；

③以含有Amp抗性的穿梭质粒pUC6为模板，PCR扩增出KanMX抗性基因；