[发明专利]耐高糖面包酵母菌株的构建及其选育方法

权利要求书

1.一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株，是对面包酵母出发菌株进行基因改造所得，其特征在于，所述基因工程改造为利用VPS8启动子替换SUC2本身的启动子调控蔗糖酶编码基因SUC2的表达。

2.如权利要求1所述的一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32253。

3.如权利要求1或2所述的一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株，其特征在于，所述VPS8启动子核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

4.一种构建权利要求1所述的面包酵母菌株的方法，包括如下步骤：

(1)将VPS8启动子序列VPS8p和SUC2启动子的下游序列两个片段通过融合PCR连接；

(2)将SUC2启动子的上游序列片段、步骤(1)所得的连接片段及标记基因KanMX片段插入pUC19质粒中，得到重组质粒；

(3)以重组质粒为模板扩增出含有SUC2启动子的上游序列、SUC2启动子的下游序列和VPS8p序列的融合片段及标记基因KanMX的重组片段，将重组片段转化入出发菌株的a型和α型单倍体菌株中，得到重组后的基因工程单倍体菌株；

(4)将pGAPza质粒导入所述重组后的基因工程单倍体菌株中，纯化并融合后得到所述基因工程菌。

5.根据权利要求4所述的一种面包酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述出发菌株为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32253。

6.根据权利要求4或5所述的一种面包酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)重组质粒的构建

①以面包酵母CICC32253总DNA为模板，PCR扩增出VPS8启动子序列VPS8p以及SUC2启动子的上、下游序列；

②将VPS8p和SUC2启动子的下游序列进行融合PCR得到连接片段；

③以含有Amp抗性的穿梭质粒pUC6为模板，PCR扩增出KanMX抗性基因；

④将步骤(1)-①获得的SUC2启动子的上游序列、(1)-②获得的连接片段以及(1)-③获得的KanMX基因依次连接到含有Amp抗性的pUC19质粒载体上，获得重组质粒；

(2)SUC2启动子的替换

①以步骤(1)中的重组质粒为模板，扩增出含有SUC2启动子的上游序列、VPS8启动子序列VPS8p与SUC2启动子的下游游序列的融合产物及标记基因KanMX的重组片段；

②用醋酸锂转化法将(2)-①中的重组片段转化入出发菌株的a型和α型菌株中，得到重组后的基因工程单倍体菌株；

(3)KanMX抗性基因的去除

①利用醋酸锂转化法将pGAPza质粒转入步骤(2)-②中的基因工程单倍体菌株中；

②用Zeocin抗性平板筛选转化子，挑选在YEPD平板上生长而在G418平板上不生长的基因工程单倍体菌株；

(4)pGAPza质粒丢失

将步骤(3)-②中挑选的a型和α型基因工程单倍体菌株于YEPD液体培养基中进行传代培养，选取第一代及第十代以后各培养物提取酵母质粒并以此为模板，用引物进行PCR扩增，验证pGAPza质粒是否丢失；

(5)获得基因工程菌

将步骤(4)中验证得到的pGAPza质粒丢失的a型和α型单倍体酵母突变株经纯化后进行融合，筛选双倍体即得到所述基因工程菌。

7.根据权利要求4或5所述的一种基因工程菌的构建方法，其特征在于：用于构建所述重组质粒的载体为含有Amp抗性的pUC19质粒。

8.权利要求1或2所述的一株适合高糖面团发酵的面包酵母菌株在面包发酵中的应用。

9.一种检测如权利要求1所述面包酵母菌株的方法，其特征在于，以重组菌株的总DNA为模板，通过引物对：

上游:5′-GGGGTGCGGGTTTTTGTATTGCTAAT-3′

下游:5′-GCCGTCATAATCCATTTTTGAGAAG-3′

进行PCR扩增，可获得一条长度为2025bp的特异性条带，所述特异性条带核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。