[发明专利]可同时鉴别猪繁殖与呼吸综合症病毒的RT-PCR技术

说明书

技术领域    

    本发明属于重大动物疫病检疫检测领域，具体涉及到一组用于可同时区别猪繁殖与呼吸综合症野毒株（包括经典毒株、高致病性毒株）和疫苗毒株区别诊断的RT-PCR引物、操作方法及其临床应用。

背景技术    

    猪繁殖与呼吸病毒PRRSV是一种单股正链RNA病毒，有囊膜，归属于冠状病毒科、动脉炎病毒属。

    猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)引起的急性热性高度接触性传染病，临床上引起妊娠母猪繁殖障碍，仔猪和育肥猪呼吸症状。该病首次报道于美国（1987年)，此后该病已呈世界性分布，世界多国均见有PRRSV感染的报道，给世界养猪业造成巨大损失，已经被国际兽医局(OIE)列为B类传染病，我国也将经典猪繁殖与呼吸综合症列为二类动物传染病；2006年发生在中国的由变异毒株引起的高致病性蓝耳病，造成重大损失，被列为一类动物传染病。鉴别诊断经典和高致病性猪繁殖与呼吸综合症具有重要的临床意义。

    对于PRRSV的防治，除了采用疫苗进行定期的免疫接种外，尚无特异性治疗方法。而目前用于PRRSV防制的主要为弱毒疫苗，大规模应用弱毒疫苗使得区分动物发病与疫苗免疫变得困难。鉴别疫苗毒和野毒是非常关键的，是判定疾病的前提，可用于引种和免疫净化疾病。

目前常用的PRRSV诊断方法有很多,包括病毒中和试验、酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光试验、免疫组织化学，但存在操作复杂费时，特异性不强的缺点，且又很难鉴别PRRSV野毒感染和疫苗接种。而近年来发展起来的实时荧光定量PCR（realtime PCR）以操作简单，灵敏度高、速度快为优点，但由于实验仪器及试剂昂贵，很难普遍用于基层实验室，不利于疾病早发现和早处理。

综上，迫切需要建立一种可以鉴别诊断PRRSV疫苗毒株和高致病性毒株、经典毒株野毒感染的敏感而特异检测方法，对蓝耳病的监测防控和免疫净化发挥重要作用。

发明内容    

本研究建立了可以同时区别诊断PRRSV野毒（包括经典毒株、高致病性毒株）和疫苗毒株感染的敏感而特异的RT-PCR引物和检测方法，可以普遍适用于基层检疫和临床应用。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：

用于区分检测猪繁殖与呼吸综合症病毒野毒株与疫苗株的RT-PCR引物包括正义引物和反义引物：

名称序列（5’-3’）正义引物CGACACCATCCGAGCCG反义引物CCTGCACCTGTGTCATCAAGC

注：胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）   。

本发明提供了一种用于可同时区分PRRS野毒株（包括经典毒株、高致病性毒株）和疫苗株的方法，包括以下步骤：

1）提取RNA ：

   用DEPC(0.1%)H₂O溶解疫苗毒株干粉，取200μl疫苗，使用RNAiso plus提取RNA，其他步骤如常规提取到RNA，用20μl无RNA酶的DEPC(0.1%)H₂O溶解RNA；

2）RT-PCR两步法：