[发明专利]可同时鉴别猪繁殖与呼吸综合症病毒的RT-PCR技术

权利要求书

1.可同时鉴别猪繁殖与呼吸综合症病毒的RT-PCR技术，其特征在于，步骤为：

1）用于区分检测猪繁殖与呼吸综合症病毒野毒株与疫苗株的RT-PCR引物包括正义引物和反义引物，分别为：

名称序列（5’-3’）正义引物CGACACCATCCGAGCCG反义引物CCTGCACCTGTGTCATCAAGC

2）提取RNA ：

   用DEPC(0.1%)H₂O溶解疫苗毒株干粉，取200μl疫苗，使用RNAiso plus提取RNA，用20μl无RNA酶的DEPC(0.1%)H₂O溶解RNA；

3）RT-PCR两步法：

   以上一步骤提取的RNA为模板，配制10μl反转录体系进行反转录，10μl反应体系的配制：Random primer终浓度为2μM，20μM Random primer 1μl、10μM dNTPs 0.5μl、5x M-MLV buffer 2μl、RNase Inhibitor (40U/μl) 0.5μl、 RTase M-MLV (RNase H-) 0.5μl、RNA模板5μl、RNase-free H₂O 0.5μL；

反转录程序为：30℃ 10 min、42℃ 60min、70℃ 15min、4℃ 5min，得到反转录产物；

配制PCR混合体系：20μM正义引物和反义引物各0.5μl，2.5μM dNTPs 8μl,10xPCR buffer（Mg²⁺) 5μl，TAKARA Taq(5U/μl) 0.5μl，反转录产物2μl，用灭菌去离子水补充至25μl，PCR反应程序：95 ℃ 5min，以94 ℃ 30s、55 ℃ 30s 和72 ℃ 1min进行30个循环，72 ℃ 10min，4 ℃ 5min，得到产物；

4）电泳观察：取10μl 的上述产物，经3%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察。