[发明专利]一种基于核酸适配体探针荧光传感分析检测待测样本中的靶标物质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于核酸适配体探针荧光传感分析检测待测样本中的靶标物质的方法。

背景技术

以核酸适配体为生物识别材料的传感分析方法在最近二十多年得到了飞速发展。核酸适配体是一段能够特异性识别目标污染物的RNA或单链DNA片段。早在上个世纪九十年代，Nature和Science期刊几乎同时首次报道了核酸适配体材料及其筛选技术。经过二十几年的发展，目前已经报道的核酸适配体材料已经可以检测环境中的上百种物质。

以核酸适配体为生物识别元件的传感分析方法包括可分为均相和非均相(或异相)适配体传感分析两种方法。目前，均相法的核酸适配体传感技术仍然是主流。比如，University of Illinois at Urbana-Champaign大学Lu Yi课题组利用在核酸适配体探针上固定荧光基团和猝灭基团，基于靶标物质识别后产生的DNA构象变化实现荧光信号的增强或减弱，从而建立起靶标物浓度与荧光信号的定量关系。均相反应速度快，检测过程简单，然而试剂消耗量大、检测成本高。固相法通常以固定单链DNA探针为主，基于DNA探针对杂交链和靶标物亲和能力的差异实现检测。为实现多次使用，需要将杂交后的DNA链或靶标物洗脱。已经报道的洗脱方法包括：酸洗/碱洗、加热、高盐洗脱、EDTA螯合、表面活性剂洗脱等。缺点是稳定可重复使用的次数非常有限，通常在5-15次之间。究其原因是DNA的三级构象非常脆弱，在各种洗脱条件下，很难恢复到初始状态。这样低的稳定重复使用次数也极大限制了固相DNA技术的发展和适用范围。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于核酸适配体探针荧光传感分析检测待测样本中的靶标物质的方法。

本发明提供了一种检测待测样本中是否含有靶标物质的方法，包括如下步骤：

(1)将功能磁珠与所述待测样本共孵育；所述功能磁珠是将(a)和(b)杂交得到的；所述(a)为表面修饰有特异识别靶标物质的核酸适配体的磁珠；所述(b)为连接有链霉亲和素和标记物的探针；所述探针为与所述核酸适配体部分互补的单链核酸分子；

(2)完成步骤(1)后，进行磁分离，收集上清液；

(3)在与标记物相应的的激发波长激发下，采用表面修饰有脱硫生物素或生物素的固相芯片检测步骤(2)得到的上清液，根据信号值判断待测样本中是否含有靶标物质。

所述表面修饰有脱硫生物素的固相芯片的制备方法包括如下步骤：

(Ⅰ)取固相芯片，使其表面羟基化；

(Ⅱ)完成步骤(Ⅰ)后，取固相芯片，使其表面修饰APTS；

(Ⅳ)完成步骤(Ⅱ)后，取固相芯片，使其表面修饰脱硫生物素。

“取固相芯片，使其表面羟基化”的方法具体如下：①将固相芯片浸入piraha溶液(98％浓H₂SO₄:H₂O₂＝3:1，体积比)并120℃反应1h；②完成步骤①后，取出固相芯片，用超纯水清洗直到pH值为中性，在室温下用氮气吹干，然后置于70℃真空干燥箱中保存1h。

“取固相芯片，使其表面修饰APTS”的方法具体如下：①取固相芯片，置于APTS溶液中反应1h；②完成步骤①后，取出固相芯片，用无水甲苯冲洗，在室温下用氮气吹干，然后置于200℃烘烤1h。APTS溶液：溶质为APTS，溶剂为无水甲苯，溶质的浓度为2％(体积比)。

“取固相芯片，使其表面修饰脱硫生物素”的方法具体如下：①取固相芯片，置于戊二醛溶液中室温反应1h，然后用乙醇冲洗，然后置于乙二胺溶液中室温反应1.5h，然后置于NaBH₄溶液中室温反应15min；②取25mg脱硫生物素、50mg EDC和50mg NHS，用1000μl DMF溶解，室温反应3h，然后加入200μl pH8.7、1M的NaHCO₃-Na₂CO₃缓冲液并混匀，得到混合液；③完成步骤①后，取出固相芯片，加入步骤②得到的混合液中，室温反应12小时；④完成步骤③后，取出固相芯片，用乙醇冲洗，然后置于含2mg/mL BSA的PBS缓冲液中，室温反应1h。戊二醛溶液：溶质为戊二醛，溶剂为乙醇，溶质的体积百分比浓度为2.5％。乙二胺溶液：溶质为乙二胺，溶剂为乙醇，溶质的体积百分比浓度为10％。NaBH₄溶液：溶质为NaBH₄，溶剂为乙醇，溶质的浓度为10mg/ml。