[发明专利]利用血红密孔菌制备含有漆酶发酵液的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵，特别是指一种利用血红密孔菌制备含有漆酶发酵液的方法。

背景技术

漆酶是一种含铜多酚氧化酶，能催化酚类物质的氧化还原反应。漆酶具有底物非特异性的特殊性能,对许多结构不同、难降解的高分子有机物质具有广谱的降解能力，其应用涉及造纸、纺织、木材加工、饮料食品、土壤修复和生物能源等多个领域。漆酶作为生物催化剂，与物理的和化学的方法相比，其生物催化更具有高效率、低能耗的优点。

当前，国内市场漆酶的主要来源是美国Sigma公司和丹麦诺维信公司，由于其价格昂贵等原因严重制约了其在国内相关领域的应用。自然菌种中漆酶产量普遍较低，远不能满足生产和研究的需要，能否获得大量用于生产和研究的价格合理的漆酶制剂成为制约漆酶应用的关键因素之一。

中科院微生物研究所在专利号为200910083514.7的发明专利中公开了“一种漆酶及其制备方法与专用生产菌株”，该专利中利用血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)CGMCCNo.2932发酵制备的漆酶酶活可达到300u/ml,但公布的配方和工艺均为摇瓶发酵参数，在发酵罐上放大培养的可再现性较差，因此，研究适用于规模化工业生产，且产酶活较高的漆酶生产工艺是目前存在的主要技术难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用血红密孔菌制备含有漆酶发酵液的方法，采用该方法所制备的漆酶适于工业化生产，且酶活较高。

本发明的整体技术构思是：

利用血红密孔菌制备含有漆酶发酵液的方法，包括在有氧及避光条件下，含有碳源、氮源及无机组分的无菌发酵培养基中培养血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)CGMCC No.2932，还包括如下步骤：

发酵培养基采用如下质量份数的组分组成：

玉米粉20-40，麸皮粉3-10，酒石酸铵1-5,磷酸二氢钾1-1.5，七水合硫酸镁0.2-0.2，琥珀酸钠0.8-1.0,五水合硫酸铜0.15-0.25，六水合氯化钾0.01-0.05,七水合硫酸锌0.01-0.04,表面活性剂0.1-0.5,消泡剂0.01-0.05，水1000，pH自然；

发酵的条件是：

接种量为8％-10％，0-3天：通风比为1:0.3-0.4vvm，温度30℃-32℃；4-6天：通风比为1:0.7-0.9vvm，温度30℃-32℃；7-9天：通风比为1:1.0-1.4vvm，温度30℃-32℃；10-11天：通风比为1:1.0-1.2vvm，温度30℃-32℃；第三天流加甲醇诱导剂8-15ul；在第3天、第5天、第7天、第9天每天流加补水500-1000ml，第5-8天每天流加浓度为5mg/l硫酸铜溶液1-3ml，发酵周期为10-12天。

本发明的具体技术内容还有：

所述的表面活性剂选用吐温-80，消泡剂选用泡敌。

为缩短发酵周期，常见且优选的技术实现方式是，将血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)CGMCC No.2932保藏的试管斜面种子接入平皿，扩大培养后再接入摇瓶制成种子液；将种子液接种至发酵罐无菌发酵培养基进行培养。

其中较为优选的实现方式是，所述的扩大培养是将斜面菌种直接制成克氏瓶种子。

为进一步缩短培养周期，更为优选的实现方式是，扩大培养中克氏瓶培养基采用如下方法制备：将麦芽汁培养基稀释至12柏林，加入琼脂15克。

所述的扩大培养方法如下：将斜面菌种室温活化2-4小时后接种至灭菌后的克氏瓶培养基，在28℃-32℃条件在培养3-4天制成克氏瓶种子。

本发明漆酶活力的测定是用2，2’-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(英文简称ABTS){2，2’-azino-bis-[3-ethylthiazoline-6-sulphonate]}来测定的。一个酶活力单位U的定义：在下述条件下，每分钟内催化1μM底物的酶量。

酶活力的计算公式为U＝A·V/(ε·L·T)

公式中：A表示紫外分光光度计吸收值的变化

V表示反应体系的体积(单位：mL)，

ε＝3.6×10⁴M·cm^-1＝36(μmol/ml)^-1·cm^-1，为氧化型ABTS的摩尔消光系数，L为比色皿的光径(单位：cm)，T为反应的时间(单位：分钟)。