[发明专利]一种PGC1-α基因DNA甲基化检测试剂及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术及医学领域，具体涉及一种PGC1-α基因DNA甲基化检测试剂及其应用。 

背景技术

过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator1α，PGC1-α)，由PPARGC1A基因编码，是转录辅助激活因子PGC1家族中最出名的成员，也是近年来细胞及线粒体代谢研究的热点之一。PGC1-α一方面能增强线粒体的合成功能；另一方面能够减少线粒体代谢副产物的堆积，它可通过调控许多ROS清除酶的活性而减少ROS的毒性作用。因而，PGC1-α对整个线粒体代谢发挥了积极的调节作用。不仅如此，PGC1-α还具有能够促进脂肪代谢、减轻体重，能调控骨骼肌细胞中肌纤维类型的转换，能促进糖异生等代谢过程的重要作用。正因如此，PGC1-α已成为治疗糖尿病(Diabetes mellitus，DM)等代谢疾病的新靶点。研究发现，PGC1-α在DM患者的肌肉中表达是降低的，这可能与DM和胰岛素抵抗引起的代谢紊乱有关。胰岛中编码PGC1-α的基因PPARGC1A基因启动子区甲基化的增加可导致胰岛β细胞功能下降引起胰岛功能紊乱。但是，目前PGC1-α在糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy，DR)及其代谢记忆中发挥的作用尚不明确，有待进一步研究。 

DR是糖尿病最常见和最严重的眼部并发症，是工作年龄段人群最主要的致盲原因。目前全球DM患者人数高达3.47亿，近30％的DM患者有不同程度的DR，3730万DR患者的视力受到威胁。控制血糖是治疗DM及其并发症的关键。然而多个大型的临床研究发现，若早期血糖控制不佳，即使后续血糖控制达标，仍较早期血糖控制良好的患者更易发生DR等并发症，这种现象称之为“代谢记忆”(Metabolic memory，MM)。 

随着后基因组时代的到来，表观遗传学(Epigenetics)已成为生命学科的研究前沿。表观遗传学是针对遗传学而言的，是指研究DNA序列不发生改变的可遗 传的基因表达变化的科学，它可以解释一些经典遗传学所不能解释的问题。目前表观遗传学研究主要集中DNA甲基化及组蛋白乙酰化上。DNA甲基化修饰是基因组表观遗传调控中主要的方式，人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关，基因启动子区CpG岛高甲基化可导致抑癌基因表达沉默进而导致肿瘤发生。DNA甲基化是指在甲基化转移酶的作用下，以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到CG二核苷酸胞嘧啶的5号碳原子上，形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化异常是细胞癌变过程中早期、频发事件，因此特异基因的甲基化可作为癌症早期诊断的分子标志物、治疗靶点和判断预后手段。 

本发明研究了PGC1-α及其表观遗传修饰在DR代谢记忆中的作用。研究在体外培养的视网膜微血管内皮细胞中PGC1-α和SOD2mRNA及蛋白的表达水平，分析高糖对PGC1-α和SOD2mRNA及蛋白表达的影响以及是否具有代谢记忆现象。同时检测编码PGC1-α的PPARGC1A基因启动子区CpG岛的甲基化状态，找到了一个与代谢记忆效应相关的甲基化位点。进一步的，本发明还根据该甲基化位点设计并合成了其甲基化检测引物并制备了适用于该甲基化位点的检测试剂盒，所述试剂盒可用于DR代谢记忆早期诊断，具有很好的临床应用价值。 

发明内容

本发明的目的在于证实PGC1-α基因及其表观遗传修饰在DR代谢记忆中的作用。所述的对PGC1-α基因及其表观遗传修饰的检测可用于DR代谢记忆早期诊断。 

本发明的另一个目的在于制备出PGC1-α基因甲基化检测试剂，所述检测试剂可用于DR代谢记忆的早期诊断、筛查和患病风险预测。 

发明人发现并通过实验证明，PGC1-α基因的一个位点(+171位点，具体见序列表中SEQ ID NO1，所述+171位点位于SEQ ID NO1第459个碱基处)在高糖引起的糖代谢记忆细胞中高度甲基化，而在正常对照中均处于非甲基化状态，提示PGC1-α基因中位点(+171)的甲基化是糖尿病代谢记忆的早期诊断标志。 

本发明在上述研究基础上，提供一种检测试剂，采用所述的检测试剂组分中的一种或几种可以检测PGC1-α基因位点+171的甲基化程度。 

进一步，所述的检测试剂包括DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒和PGC1-α基因位点+171甲基化检测试剂盒。