[发明专利]一株海洋解淀粉芽孢杆菌及其培养方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，本发明涉及一种鳗弧菌拮抗菌新菌株的分离方法特别是一种海洋解淀粉芽孢杆菌B5的分离方法本发明还涉及前述分离方法得到的海洋解淀粉芽孢杆菌B5及其发酵产物的应用。

背景技术

弧菌是引起水产养殖鱼类细菌性疾病的最重要一类病原菌。由弧菌引起的疾病,流行面积广,发病率高,给养殖业造成了巨大危害,长期以来是水产领域研究的一大热点。

鳗弧菌可以侵染大多数鱼类,是对水产养殖危害最大的弧菌,也是被研究和报道最多的弧菌。早在1718年就有了关于鳗鲡感染弧菌病的文字记载,而且意大利西北沿海地区养殖的鳗鲡在1790年就因弧菌病的暴发性流行而导致36t鳗鲡在不到1个月的时间内全部死亡。鳗弧菌是引起水产养殖动物败血症的重要病原之一，由其引起的弧菌病是我国水产养殖鱼类的主要疾病，感染的养殖品种涉及大菱鲆、牙鲆、半滑舌鳎、鲈鱼、美国红鱼、鳗鲡、大西洋鲑等50多种重要养殖品种，大多数海水养殖鱼类都容易被该菌感染,英国就曾报道过：野生鳗鲡因感染了鳗弧菌大量死亡的事例。感染鳗弧菌后的病鱼主要出现出血性败血症、体表肿胀、发炎等症状。引起我国养殖鱼类产业的重大经济损失。

为了控制和预防水产病害的流行爆发，长期以来水产病害控制主要依靠各种农药、抗生素、喹诺酮类、磺胺类、呋喃类等化学药物及各种消毒剂。这些化学药物和抗生素盲目使用，虽然在一定程度上可快速抑制或杀死病原菌，有效地控制疾病的发生和蔓延，提高水产养殖动物的生存率。但药物防治存在的弊端也越来越明显，产生了很多负面效应：抗药性病原株的产生，抗生素及化学药物使用量逐渐加大，水产品中药物残留危及食品安全，抗药性病菌菌株质粒转移到人类病原菌中，增加人类疾病治疗的困难程度，给人类健康带来了巨大威胁。基于这些负面效应人们开始寻找绿色安全抗生素和化学药物的替代品用于水产动物疾病的防治。

随着微生物学研究技术的发展,世界各国对海水养殖动物弧菌病防治的研究越来越多，而利用益生菌的拮抗作用来防治弧菌病的研究更是一大热点。但利用海洋解淀粉芽孢杆菌或其发酵产物或提取物应用于水产病害防治，特别是应用于鳗弧菌病害防治及药物开发国内外未见相关的专利、文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种来自海洋解淀粉芽孢杆菌B5或其发酵产物或提取物应用于水产病害抗菌与防治，特别是应用于鳗弧菌病害防治及药物的用途。本发明所要解决的另一技术问题是提供了海洋解淀粉芽孢杆菌B5的分离方法。为了寻找新的鳗弧菌拮抗微生物及新型鳗弧菌抑制剂，本申请的发明人从江苏连云港海域分离海洋微生物并制取其发酵产物，然后对获得的发酵产物的鳗弧菌拮抗及抑制活性进行了研究。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明公开了海洋解淀粉芽孢杆菌B5对水产致病菌鳗弧菌的拮抗与防病用途，所述鳗弧菌为Vibrio anguillarum保藏于中国典型培养物保藏中心菌种编号：CCTCC M203069。

本发明中涉及的海洋解淀粉芽孢杆菌B5的分离方法步骤如下：

⑴样品的采集与富集在连云港海域用无菌采样袋及无菌采样工具采集海水，海泥，海带，浒苔，裙带菜，龙须菜，紫菜样品。注明样品名称、采集日期以及采集地点。

⑵样品进行如下处理：海水样品采集来的海水混匀取10mL加入到装有100mL无菌海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d。海泥样品采集来的海泥混匀采用五点法采样再混匀，取10g海泥放入事先灭好菌的装有100ml海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d。海带样品用无菌海水冲洗海带样品3次后，放入无菌组织捣碎机中破碎至糊状，取10g浒苔破碎物加入到装有100mL无菌海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d。浒苔，裙带菜，龙须菜，紫菜样品处理同海带样品处理。

⑶海洋细菌的分离及纯化分别取1mL上述样品富集培养物的清液放入盛有9mL无菌海水的试管中进行梯度稀释取10-4、10-5、10-6稀释度样品0.1mL涂布到直径9cm的海水TSB固体分离培养基平板上，28℃倒置培养2d，每个稀释梯度重复3次观察并挑取形态、颜色不同的菌落采用三区划线方法进行纯化得到若干海洋细菌纯菌株。