[发明专利]一株海洋解淀粉芽孢杆菌及其培养方法和应用

权利要求书

1.一种海洋细菌，其特征在于：该细菌分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2014年5月27日，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2014229。

2.根据权利要求1所述的一种海洋细菌，其特征为：所述细菌的gyrB基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示，NCBI登记号为JN859130.1。

3.根据权利要求2所述的一种海洋细菌，其特征为：所述细菌的16SrDNA基因序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

4.一种如权利要求1-3任意一项所述的海洋细菌的用途，其特征在于：所述海洋解淀粉芽孢杆菌对鳗弧菌的拮抗。

5.一种如权利要求1-3任意一项所述的海洋细菌的分离方法，其特征在于，其步骤如下：

⑴样品的采集：在连云港海域用无菌采样袋及无菌采样工具采集海水、海泥、海带、浒苔、裙带菜、龙须菜、紫菜样品，注明样品名称、采集日期以及采集地点；

⑵样品的富集：

海水样品采集来的海水混匀，取10mL加入到装有100mL无菌海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中，28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d得到海水富集培养物；

海泥样品采集来的海泥采用五点法采样再混匀，取10g海泥放入事先灭好菌的装有100ml海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中，28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d得到海泥富集培养物；

海带样品用无菌海水冲洗海带样品3次后，放入无菌组织捣碎机中破碎至糊状，取10g海带破碎物加入到装有100mL无菌海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中，28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d得到海带富集培养物；

浒苔、裙带菜、龙须菜和紫菜样品处理同海带样品处理，分别得到浒苔、裙带菜、龙须菜和紫菜富集培养物；

⑶海洋细菌的分离及纯化：分别取1mL上述富集培养物的清液放入盛有9mL无菌海水的试管中，进行梯度稀释，取10^-4、10^-5、10^-6稀释度样品0.1mL涂布到直径9cm的海水TSB固体分离培养基平板上，28℃倒置培养2d，每个稀释梯度重复3次，观察并挑取形态、颜色不同的菌落，采用三区划线方法进行纯化，得到若干海洋细菌纯菌株；

⑷鳗弧菌拮抗菌的分离和筛选：将鳗弧菌在无菌条件下，挑取2-3环菌体接种到装有100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中，28℃、180r/min的条件下摇床培养18小时，获得鳗弧菌种子液；取0.1ml上述鳗弧菌种子液涂布到海水TSB固体平板上，在上述每只平板上均匀点种一株步骤⑶中获得的海洋细菌，在28℃条件下进行共培养36小时，观察并测量抑菌圈大小，筛选出对鳗弧菌具有拮抗效果的海洋细菌。

6.一种具有抑制鳗弧菌活性的发酵产物，其特征在于，所述的发酵产物由权利1-3任意一项所述的细菌经过液体发酵获得。

7.如权利要求6所述的一种具有抑制鳗弧菌活性的发酵产物，其特征在于，所述发酵产物由以下步骤发酵获得：

(1)菌种活化：取如权利要求1-3任意一项所述的海洋细菌，采用划线法接种于海水TSB固体斜面培养基上，28℃培养18小时，得到对数生长期的斜面培养物；

(2)种子液制备过程：将海洋解淀粉芽孢杆菌B5的固体斜面培养物在无菌条件下，挑取2-3环菌体接种到装有100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中，28℃、180r/min的条件下摇床培养18小时，获得海洋解淀粉芽孢杆菌B5种子液；

(3)发酵培养过程：在通气搅拌式发酵罐内加入海水TSB液体培养基，在121℃下维持15min灭菌后冷却；种子液预先利用无菌海水调整种子液的浓度至2.0*10⁷cfu/ml，种子液的接种量按2％(v/v)接入，接入种子液之后搅拌发酵；搅拌发酵环境参数为：通气量1.2vvm，温度为28℃，搅拌速度为每分钟150转；发酵时间为：36小时，获得发酵产物。

8.一种如权利要求7所述的发酵产物的用途，其特征在于：所述发酵产物用于防治鳗弧菌病害。