[发明专利]一种副溶血性弧菌分子检测方法及使用的引物对

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种副溶血性弧菌分子检测方法及使用的引物对。

背景技术

副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus，Vp)是一种革兰氏阴性嗜盐性细菌，属弧菌科(Vibrio)弧菌属，主要存在于近海岸的海水、海底沉积物和鱼类、虾类、贝类、牡蛎等海产品中。人多因食用被本菌污染而又未煮熟的海产品而引起中毒。我国每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的报道，近年来世界发病率呈上升趋势。目前，对于副溶血弧菌的传统检测方法大多要经过前增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定、神奈川现象和血清学反应等过程。这些实验操作繁琐,需耗时5-6天，给海产品生产、出入境检验检疫、食品卫生监督等带来困难，影响经济发展。目前，学者对副溶血弧菌的分子检测的方法大多基于tlh、tdh、gyrb、pr72H等基因，但大多方法被后来的试验数据否定，而现在缺乏可被公众认可的分子检测方法。故建立一种简便、快速特异而严谨的分子检测技术迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一对用于副溶血性弧菌分子检测的特异性引物对。

本发明的另一目的是提供该引物对的应用。

本发明的又一目的是提供一种副溶血性弧菌分子检测方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

本发明引物设计和分子检测方法的建立基于副溶血性弧菌的toxRS基因。ToxRS，即toxR和toxS，为弧菌的毒素操纵子基因，toxS基因序列位于toxR下游，两者的连续基因合称为toxRS。基于该基因的可变区设计引物，建立副溶血弧菌的分子检测方法。

一对用于副溶血性弧菌分子检测的特异性引物对，上游引物toxRS-F为SEQ ID NO.1，下游引物toxRS-R为SEQ ID NO.2。

本发明所述的引物对在制备检测副溶血性弧菌的检测试剂中的应用。

一种用于副溶血性弧菌分子检测的试剂盒，包含本发明所述的特异性引物对。

本发明所述的试剂盒，还包含Taq PCR Master Mix。

本发明所述的引物对在检测副溶血性弧菌中的应用。

一种副溶血性弧菌分子检测方法，使用所述的特异性引物PCR扩增待检样品的DNA，如果能够扩增得到679bp的片段，则说明待检样品中含有副溶血性弧菌。

所述PCR扩增的反应体系为25μl：2×Taq PCR Master Mix12.5μl，dd H₂O9.5μl，上游、下游引物各1μl，DNA模板1μl；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环，最后72℃延伸10min。

有益效果：

副溶血性弧菌PCR检测方法的建立，要求既不能出现假阳性——即严格的种特异性，也不能出现漏检——即重复性良好，故要选择种特异性的靶基因，并排除特异血清型、亚型以及毒力基因序列。本发明在参考大量文献以及分析基因序列的基础上，排除毒力基因、亚型以及血清型特异基因，锁定副溶血弧菌可能存在的种特异性序列。引物的特异性与靶基因的特异性的起着同等重要的作用，对于副溶血性弧菌的检测特异性和灵敏度具有着重大的影响。本发明经过反复比对和筛选，确定了以toxRS基因(GenBank编号L11929.1)的第579—1258个碱基作为靶序列，并设计了特异性引物对toxRS-F/toxRS-R，从理论层面保证本方法具有很高的特异性。

本试验用2×Taq PCR Master Mix替代传统PCR体系中的10×buffer、MgCl2、dNTP、Taq酶，省时省力且减小操作误差。PCR程序中，较高的退火温度能在一定程度上能提高引物的特异性，但并不代表越高越好。故应在能遵循特异性、重复性、灵敏性良好的基础上，选择最高的退火温度。试验结果证明，59℃为最适退火温度。最终确定的PCR程序参数为：94℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环，最后72℃延伸10min。