[发明专利]利用基因组原位杂交快速构建黄瓜中期染色体核型方法

说明书

一、技术领域

本发明公开了利用黄瓜自身基因组原位杂交技术快速构建黄瓜有丝分裂中期染色体核型的方法，有利于开展黄瓜及其它物种的核型分析研究，属于植物生物技术领域。

二、技术背景

黄瓜(Cucumis sativus L.，2n＝2x＝14)是世界上最重要的蔬菜作物之一。黄瓜具有一些特殊的性状，如性别表型多样化、线粒体的父性遗传性等；同时黄瓜的基因组相对较小(约370Mb)，染色体数目少，仅为14条，使得黄瓜成为近年来分子细胞遗传学研究的模式物种之一。然而黄瓜中期染色体小，染色能力弱，且染色体间形态很相似，对其分子细胞遗传学的研究虽然已有几十年之久，但对其核型分析或染色体的识别往往需要借助多种复杂的方法。

核型是指染色体组在有丝分裂中期的表型。包括染色体的数目、大小和形态的总和。染色体核型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间关系所不可缺少的重要手段。不同物种的染色体都有各自特定的形态结构(包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等)特征，而且这种形态特征是相对稳定的。核型分析可以为细胞遗传分类、物种间亲缘的关系、以及染色体数目和结构变异的研究提供重要依据。因此，在细胞遗传研究领域中具有重要意义。

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术的发展及应用，为准确鉴定植物染色体提供了有效的方法。Koo等(2005)利用随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNAs，RAPDs)标记产物为探针的FISH研究，并结合C带分析，准确识别出了每条黄瓜染色体。不久，Han等(2008)利用多种卫星DNA，结合45S rDNA、5S rDNA在黄瓜染色体上分布的不同，对黄瓜有丝分裂中期的染色体核型进行了分析，并建立了核型模式图。Zhao等(2011)利用多个重复序列探针及多个Fosmid克隆分别对黄瓜中期染色体进行了区分，并建立了FISH核型模式图。最近，Lou等(2014)利用黄瓜单拷贝基因为探针与45S rDNA相结合，识别出了每条黄瓜中期染色体。以上这些研究对于染色体的鉴定与识别，均需要制备多种不同类型的探针。前人的研究中，主要集中于利用C-分带、染色体特异的克隆以及多种串联重复序列等对黄瓜染色体核型进行分析，技术较为繁琐。高等植物核基因组含有大量重复序列，如玉米基因组中含85％以上的重复序列。经调查，黄瓜基因组中含有～20％-30％的卫星DNA，而这些卫星DNA中，90％以上都是串联重复序列(Type I，II，III，IV)。前人利用多个串联重复序列(Type I，II，III，IV，45S rDNA等)探针组合的FISH杂交，根据不同探针在黄瓜染色体上信号分布及信号强度的不同，采用多次重复杂交的方法，对黄瓜有丝分裂中期染色体进行了准确的识别分析，然而，该方法同样需要制备各种不类型的探针，技术流程较为繁琐。基因组原位杂交能有效地反应基因组中的重复序列分布特征，黄瓜基因组中的重复序列多为串联重复序列，且在不同染色体上存在明显特征性的分布模式，这为利用基于基因组原位杂交进行核型的构建提供了可能。

目前，利用自身基因组荧光原位杂交分析，分析黄瓜基因组重复序列的分布特征，从而构建黄瓜有丝分裂中期染色体核型的研究尚未见报道。我们利用黄瓜基因组DNA直接作为探针与黄瓜有丝分裂中期染色体进行杂交，可以直接揭示DNA序列沿染色体的分布模式。根据杂交信号在每条染色体上分布位置及信号强度的不同，成功对黄瓜有丝分裂中期的染色体核型进行了分析。

三、发明内容

技术问题

本发明利用自身基因组原位杂交快速构建黄瓜中期染色体核型方法的目的，是针对以往黄瓜有丝分裂中期染色体核型构建方法的繁琐等不足，发明了一种仅通过黄瓜自身基因组作探针的一次基因组原位杂交(genomic in situ hybridization，GISH)即可快速构建出黄瓜中期染色体核型的方法，加快了黄瓜的细胞遗传学研究进展，并为其他物种的核型分析提供了新的方法与思路。

技术方案

本发明所提供的利用自身基因组原位杂交快速构建黄瓜中期染色体核型，其特征在于：仅通过一次GISH试验即可对黄瓜有丝分裂中期染色体进行准确的识别。

上述利用自身基因组原位杂交能够快速构建黄瓜中期染色体核型，是通过以下方法获得的：