[发明专利]编码具有D‑丝氨酸合成活性的酶的DNA、该酶的制备方法及D‑丝氨酸制备方法

说明书

本申请是申请日为2005年10月7日、申请号为200580034899.8(国际申请号为PCT/JP2005/018906)、发明名称为“编码新型的具有D-丝氨酸合成活性的酶的DNA、该酶的制备方法、及利用该酶的D-丝氨酸制备方法”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及编码具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的新型酶的DNA、将该DNA整合到载体中形成的重组DNA、由该重组DNA转化得到的转化体、具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的新型酶及利用该酶由甲醛和甘氨酸制备D-丝氨酸的方法。

背景技术

已知D-丝氨酸作为D-环丝氨酸等医药品的合成中间体是十分有用的化合物。

目前，作为具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的酶，只公开了来自节杆菌(Arthrobacter)sp.DK-19的D-苏氨酸醛缩酶(以下，简称“DTA”)(参见特开昭58-116690号公报)。

已有报道指出，使用甲醛及甘氨酸各50mmol，在30℃下利用所述DTA使其进行反应，40小时后D-丝氨酸的生成量为2.5mmol(相对于甲醛的收率仅为5％)。

针对于此，已有报道指出，来自同为节杆菌属微生物的节杆菌sp.DK-38的DTA，尽管具有对D-苏氨酸、D-β-羟基苯基丝氨酸、D-β-羟基-α-氨基戊酸等响应的广泛的底物特异性，但不对D-丝氨酸响应(参见Eur.J.Biochem.，1997，248，p385-393)。

另外，有报道指出，通过使用来自黄单胞菌属(Xanthomonas)的DTA，能够由甘氨酸和醛类化合物制备D-β-羟基氨基酸类，但尚无使用来自黄单胞菌属的DTA由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的报道(参见特开平5-168484号公报)。

发明内容

鉴于上述背景技术，本发明的目的在于，提供编码具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的新型酶的DNA、将该DNA整合到载体中形成的重组DNA、由该重组DNA转化得到的转化体、具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的新型酶、及利用该酶由甲醛和甘氨酸制备D-丝氨酸的方法。

本发明人等认为在具有与公知的DTA类似的结构的未知酶中，可能存在具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的能力的酶，因此对与公知的DTA的氨基酸序列相关的信息进行了研究。其结果发现了与来自黄单胞菌属(GenBank登录号E05055)、无色杆菌(Achromobacter)属(GenBank登录号AB026892)、及节杆菌属(GenBank登录号AB010956)的DTA的氨基酸序列相关的信息。比较上述氨基酸序列进行研究，结果发现，DTA的N末端区域及C末端区域的氨基酸序列具有高度的同源性。

本发明人等以上述氨基酸序列中的N末端区域及C末端区域为基础设计引物，尝试使用此引物通过PCR扩增各种微生物的染色体DNA时，成功地扩增了来自无色杆菌属微生物、编码具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的酶的DNA。

与该DNA相当的氨基酸序列和公知的来自无色杆菌属的DTA的氨基酸序列的同源性约为50％左右，是与公知的来自无色杆菌属的DTA的氨基酸序列有很大差异的序列。另一方面，与公知的来自黄单胞菌属的DTA的氨基酸序列的同源性约为90％。

之后本发明人等尝试使用由将上述新型DNA整合到载体中形成的重组DNA转化得到的重组大肠杆菌(Escherichia coli)使甲醛和甘氨酸反应合成D-丝氨酸时，令人惊奇地发现，与现有公知的DTA不同，能够利用100mM甘氨酸和甲醛以反应收率在70％以上的高收率合成D-丝氨酸。

此外，还确认了如果使用此重组大肠杆菌进行D-丝氨酸累积反应，会生成微量的L-丝氨酸。

D-丝氨酸用于医药中间体等要求高纯度的领域时，不希望在D-丝氨酸中混入L-丝氨酸。由于DL-丝氨酸的溶解度比D-丝氨酸的溶解度低，因此在制备D-丝氨酸时副生的L-丝氨酸会大幅度地降低D-丝氨酸的精制收率。

为了解决此问题，本发明人等进行了更加深入的研究，结果发现，通过在2价金属离子存在的条件下实施有机溶剂处理及/或加热处理能够抑制L-丝氨酸的副生。另外，发现即使不进行上述处理，通过将反应中的甲醛浓度维持在150mM以上，也能够抑制L-丝氨酸的副生。并且发现，通过使用L-丝氨酸合成酶基因缺失的微生物作为生产用于D-丝氨酸合成的DSA的宿主，也能够抑制L-丝氨酸的副生。

基于上述发现完成了本发明。即，本发明内容如下：