[发明专利]一种DNA构建物以及DNA体外拼接方法

权利要求书

1.一种DNA构建物，其特征在于，所述DNA构建物含有结构如式I所示的核酸序列：

Ha-C-HbI

式中，Ha为第一归位内切酶酶切位点；C为待拼接的核酸序列；Hb为第二归位内切酶酶切位点；

其中，所述第一归位内切酶和所述第二归位内切酶为不同种类的同尾归位内切酶。

2.如权利要求1所述的构建物，其中，所述归位内切酶选自：I-SceI和PI-PspI。

3.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述I-SceI酶切位点包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-ATTACCCTGTTATCCCTA-3’和/或其反向互补序列；

(b)将(a)中的核酸序列经过一个或多个核苷酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能够被I-SceI酶识别的由(a)衍生的核酸序列。

4.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述PI-PspI酶切位点包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-GGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGGGT-3’和/或其反向互补序列；

(b)将(a)中的核酸序列经过一个或多个核苷酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能够被PI-PspI酶识别的由(a)衍生的核酸序列。

5.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1所述的构建物。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的基因组的一个或多个位点整合有权利要求1所述的构建物，或者所述宿主细胞中含有权利要求5所述的载体。

7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含的试剂选自下组中的一种或多种：

(a)权利要求1所述的构建物；

(b)权利要求5所述的载体；

(c)权利要求6所述的细胞；

(d)I-SceI内切酶或I-SceI内切酶表达载体；和

(e)PI-PspI内切酶或PI-PspI内切酶表达载体。

8.如权利要求1所述的构建物、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的细胞或权利要求7所述试剂盒的用途，其特征在于，用于细胞基因组的遗传改造和/或用于基因回路的构建。

9.一种DNA体外拼接方法，其特征在于，包括步骤：

(1)提供含有第一构建物的第一载体，所述第一构建物含有结构如式Ia所示的第一核酸序列，

Ha-Ca-HbIa

式中Ha、Hb的定义如权利要求1中所述，Ca为第一待拼接的核酸序列；

(2)使用第二归位内切酶酶切所述载体的第二归位内切酶酶切位点，形成线性化的第一酶切产物；

(3)提供第二构建物，所述第二构建物含有结构如式Ib所示的第二核酸序列，

Ha-Cb-HbIb

式中Ha、Hb的定义如上所述，Cb为第二待拼接的核酸序列；

并对所述第二构建物用第一归位内切酶和第二归位内切酶进行双酶切，形成经酶切的第二酶切产物；

(4)将第二酶切产物与所述的第一酶切产物进行连接反应，从而形成含有式II所示的拼接序列的载体：

Ha-Ca-Scar-Cb-HbII

式中，Ha、Hb、Ca、和Cb的定义如上所述，而Scar为拼接过程中所形成的拼接接头序列。

10.如权利要求9所述的方法，其中，所述的待拼接的核酸序列包括CDS序列、编码基因序列、抗生素生物合成基因簇、负责接合转移转移的元件或有特定功能的DNA序列。