[发明专利]一种氧化葡萄糖酸杆菌梯度强度启动子

说明书

技术领域

本发明涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌梯度强度启动子，属于基因和代谢工程领域。

背景技术

氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)WSH-003能以D-山梨醇(D-sorbitol)为底物的L-山梨糖(L-sorbose)高产菌株，且高度耐受D-山梨醇和L-山梨糖，被广泛用于工业维生素C的生产。随着Ketogulonicigenium vulgare WSH-001(以山梨糖为底物的高产2-KLG生产菌株)和G.oxydans WSH-003的基因组测序的相继公布，基因工程和生物信息学等的综合运用使维生素C一步菌的构建得到极大的促进。其中，通过构建一步基因工程菌，可在摇瓶发酵中实现从D-山梨醇到2-KLG的直接生产，但产量有待提高。除了从发酵条件优化方面提高一步菌的生产性能之外，还包括从G oxydans WSH-003中筛选比文献报道常用的强启动子(G oxydans 621H中的P_tuf)更强的启动子和系列梯度启动子用于代谢工程改造。

本发明根据G oxydans WSH-003的基因组测序结果，结合其基因组测序注释和高同源性菌株G oxydans 621H等的基因组学、蛋白质组学和代谢组学分析，查找可能的强组成型基因启动子并用生物信息学进行软件初步检测，然后再运用报告基因在G oxydans WSH-003中进行鉴定，继而最终获得强启动子和系列梯度启动子。

目前国内在氧化葡萄糖酸杆菌启动子的转录调控水平的研究较少，而大多集中于菌体改良和诱变、重要脱氢酶学性质的研究上。因此，本发明从mRNA水平研究菌体的基因表达调控，筛选调控元件，进而为氧化葡萄糖酸杆菌的代谢调控提供强力支持。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一组来源于氧化葡萄糖酸杆菌的强启动子：P_tuf-WSH003、P_sldh、P_psldh、P_sod、P_aldh。

所述启动子P_tuf-WSH003、P_sldh、P_psldh、P_sod、P_aldh的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

所述强启动子P_tuf-WSH003，是比以往文献报导的最强的Gluconobacter oxydans 621H中的P_tuf-621H还强的强启动子(Merfort,M.,et al.,High-yield 5-keto-D-gluconic acid formation is mediated by soluble and membrane-bound gluconate-5-dehydrogenases of Gluconobacter oxydans,in Appl Microbiol Biotechnol2006.p.443-51)。通过启动子截短方法，确定了其核心序列，是SEQ ID NO.1所示序列的450-599bp。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种来源于氧化葡萄糖酸杆菌的强度梯度强启动子，由P_tuf-WSH003、P_tuf-621H、P_sldh、P_psldh、P_sod、P_aldh中两种或两种以上强度不同的启动子构成。所述启动子P_tuf-WSH003、P_tuf-621H、P_sldh、P_psldh、P_sod、P_aldh的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。