[发明专利]具有增加产率的支链淀粉酶变体

说明书

本申请是发明人于2007年8月21日提交的题为“具有增加产率的支链淀粉酶变体”的中国专利申请200780031317.X的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年2月23日提交的美国临时申请US60/903,247和2006年8月23日提交的美国临时申请US60/839,735的优先权，其中每个通过全部引用并入本文。

发明领域

本发明涉及酶促肽支链淀粉酶的新型变体，编码所述新型肽的基因序列，包括那些基因序列的表达载体以及表达新型支链淀粉酶变体的生物。而且，本发明涉及这些新型支链淀粉酶肽在纺织、发酵、食品和其它工业中的应用。

发明背景

支链淀粉酶是在许多工业应用，特别是在食品和饮料工业中被发现有用的酶。支链淀粉酶是淀粉脱支酶，并在淀粉水解产物的脱支(用于改进面团性质)、β-极限葡聚糖(β-limit dextrans)的脱支(用于酿造啤酒和强麦酒(ales))以及从例如玉米、马铃薯、小麦、木薯和水稻生产糖浆中是有效的。支链淀粉酶是分类为EC3.2.1.41的酶，并且这种酶的特征是它们水解例如支链淀粉和普鲁分支葡聚糖中α-l,6-糖苷键的能力。

支链淀粉酶是细菌，特别是芽孢杆菌属的产物。用于工业应用的支链淀粉酶的生产并非没有问题。支链淀粉酶可被同样由细菌产生的各种蛋白酶快速降解，从而使大量支链淀粉酶的回收低效且昂贵。本领域技术人员已经设计了方法，以通过限制培养物中支链淀粉酶的降解来增加产量。例如，我们以前已经示出，从支链淀粉酶生产菌株删除AprL和Mpr基因(它们表达蛋白酶)对于经济表达活性支链淀粉酶是必要的。而且，发酵时间限制在51-60小时，以限制支链淀粉酶产物的蛋白水解性降解和活性损失。Svendsen设计了支链淀粉酶变体，所述支链淀粉酶变体改变酶的三维构象，以增加酶的热稳定性或改变酶如何降解其底物(见美国专利6,350,599和6,838,257以及美国申请第2004/0082028号)。

最近，我们已经示出，支链淀粉酶降解的时间被测定，结果如下：在30和50小时之间，观察全长支链淀粉酶分子部分剪切成分别缺少N-端98和102个氨基酸的截短的分子。剪切分别发生在谷氨酸残基E99和E103的N-末端，并且可以通过HPLC可见。意料不到地，1-98和1-102被截短的支链淀粉酶分子保留支链淀粉酶活性，并且，甚至更意料不到的是，表明这种活性高于全长支链淀粉酶的活性。51小时后，支链淀粉酶分子进一步降解导致活性降低，最后所有活性消失。

尽管如此，支链淀粉酶肽和编码这些肽的核苷酸序列的设计仍有改进的余地。因此，所需要的是更高效地生产支链淀粉酶的化合物和方法，例如，通过限制蛋白水解性降解，增加发酵滴度(fermentation titer)或增加支链淀粉酶活性。

发明概述

本发明涉及支链淀粉酶——一种肽酶——的新的和非显而易见形式。本发明的支链淀粉酶包括新的修饰，所述新的修饰导致生产滴度和/或耐受降解(例如，由蛋白酶引起的酶促降解)方面的优越性能和/或在靶向底物材料的分解中比亲本(“野生型”)肽更具有活性。

在这方面，本发明涉及肽SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的支链淀粉酶，分别如图7(b)、8(b)和9(b)所示。本发明还涉及编码氨基酸序列SEQ ID NOS：2、4和6的核苷酸序列。各自的核苷酸序列还分别作为SEQ ID NOS：1、3和5在图7(a)、8(a)和9(a)中示出。如本领域所熟知，遗传密码冗余，多个核苷酸密码子编码相同氨基酸。因此，本发明又涉及编码肽SEQ ID NOS：2、4和6的任何可选的核苷酸序列。本领域普通技术人员能够基于本说明书和本领域知识的教导，确定编码本发明肽序列的核苷酸序列。

本发明涉及编码本发明肽的表达构建物。本发明不限于任何特定的表达构建物，只要其能够表达本发明的肽。在这方面，合适的表达构建物的非限制性实例示意地显示在图4-6的(a)部分。